Отдел биопроцессов, компания T&J Bio-engineering (Шанхай)
Аннотация: Целью данного исследования является разработка и валидация масштабирования процесса культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека на 3д микроносителях с применением биореакторов T&J CloudReady® (500 мл) и T&J Opti-Cell mini® (3 л). Результаты двух партий показали, что МСК размножаются быстрее в 7 и 10,4 раза соответственно при использовании стратегий замены среды или эффективной подпитки.
Ключевые слова: МСК; микроноситель; биореактор
1. Введение
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) — это тип мультипотентных стволовых клеток, которые в основном получают из костного мозга, жировой ткани и пуповины. Ключевые характеристики МСК включают мультипотентную способность к дифференцировке, иммуномодулирующие свойства и способность к самообновлению [1]. МСК широко применяются в восстановлении и регенерации тканей, иммунотерапии, клеточной и генной терапии, демонстрируя огромный потенциал в биофармацевтической промышленности [2] . В настоящее время стандартные процессы производства МСК и экзосом в значительной степени зависят от систем культивирования в 2D, таких как Т-образные флаконы и многослойные флаконы-фабрики. Однако эти системы сталкиваются с проблемами, связанными со стандартизацией процессов и промышленной масштабируемостью [3–4]. В этом исследовании мы разрабатываем и проверяем процесс культивирования МСК на основе микроносителей с использованием биореакторов объемом 500 мл и 3 л, предоставляя базовые данные для будущей оптимизации процессов и их масштабирования
2. Материалы и методы
2.1 Клетки: клеточная линия MSC.
2.2 Среда: Среда для MSC, не содержащая сыворотки.
2.3 Микроносители: ТРЕХМЕРНЫЕ биомиметические микроносители, используемые в концентрации 2,5 г/л как в биореакторах объемом 500 мл, так и в биореакторах объемом 3 л.
2.4 Биореакторы: T&J CloudReady® (500 мл), стеклянный сосуд с одной трехлопастной крыльчаткой. T&J Opti-Cell mini® (3 л), стеклянный сосуд с двумя трёхлопастными импеллерами. В обеих системах используется перемешивание, направленное вниз.
2.5 Подготовка биореактора: Емкость биореактора промыли и высушили, заполнили PBS в объеме, равном рабочему объему, и откалибровали рН-электрод (двухточечный: рН 7,00, 4,01). Сосуды и датчики были собраны и стерилизованы в автоклаве (121°C, 30 мин). После стерилизации электрод был откалиброван
(0% и 100%), а также были откалиброваны значения расхода перистальтического насоса.
2.6 Параметры процесса: рабочие параметры для партий объемом 500 мл и 3 л приведены в таблице 1. В системе объемом 500 мл использовалась поверхностная аэрация. Уровень pH контролировался скоростью потока CO₂. Уровень растворенного кислорода контролировался скоростью потока O₂ при постоянной аэрации N₂. В системе объемом 3 л использовалась глубокая аэрация с помощью барботирования через открытую трубу.
Уровень pH регулировался скоростью потока CO₂, а уровень DO — скоростью потока воздуха и O₂.
| BR-500 мл | BR-3 л | |
| Концентрация микроносителей | 2.5 г/л | 2.5 г/л (финальный объем) |
| Рабочий объем | 200 мл | начальный 1 л, финальный 2 л |
| Плотность | 7×104 клеток/мл | 7×104 клеток/мл |
| Температура | 37℃ | 37℃ |
| DO | 60% | 40% |
| pH | 7.4 | 7.4 |
| Импеллер | Трехлопастной | Трехлопастной (двойной) |
| Перемешивание | (90 об/мин×30 мин+0 об/мин×30 мин)×24ч | (60 об/мин×30 мин+0 об/мин×30 мин)×24ч |
| Обороты | 90 ~ 140 об/мин | 60 ~ 70 об/мин |
| Тип аэрации | Поверхностная | Глубокая |
| Процесс | Замена среды на день 3 | Подпитка день 2, замена среды и подпитка |
2.7 Размножение клеток и инокуляция. Замороженные МСК были разморожены и восстановлены в колбах T75, а затем размножены в колбах T175 для получения посевных культур. Из биореактора с помощью перистальтического насоса был удалён PBS, и в него была добавлена свежая среда с микроносителями для предварительного культивирования при контролируемой температуре и перемешивании. В биореактор были инокулированы посевные клетки, и начался контроль параметров.
2.8 Культивирование клеток: ежедневно проводился отбор проб для подсчета клеток и биохимического анализа. Скорость перемешивания постепенно увеличивалась в зависимости от количества микроносителей и пролиферации клеток. Для поддержания уровня питательных веществ и снижения накопления метаболитов проводилась замена среды или подпитка.
Партия объемом 500 мл: 50 %-ная замена среды (100 мл) на 3-й день.
Партия объемом 3.3 л: начальный объем 1 л, добавление 500 мл на 2-й день, удаление 500 мл среды с последующим добавлением 1 л на 3-й день, конечный объем 2 л.
2.9 Сбор клеток и проточная цитометрия. В конце культивирования в партии объемом 3 л культуральную жидкость асептически удаляли и давали микроносителям осесть. Надосадочную жидкость удалили, а микроносители обработали лизирующим буфером при 37 °C в течение 60 минут. Суспензию отфильтровали (поры 100 мкм) и центрифугировали для сбора клеток, после чего провели проточно-цитометрический анализ
3. Результаты и анализ
МСК культивировали и размножали с использованием биореакторов T&J CloudReady® (500 мл) и Opti-Cell mini® (3 л) с микроносителями в двух отдельных партиях.
В партии объемом 500 мл с рабочим объемом 200 мл и инокулятом 7×10⁴ клеток/мл МСК культивировали в течение 96 часов. Плотность клеток на микроносителях увеличилась в 7 раз (рис. 2). Динамика содержания глюкозы/лактата и глютамина/аммония показана на Рисунках 3 и 4. Конечная плотность клеток приближалась к насыщающей способности поверхности микроносителя. Снижение плотности инокуляции может улучшить
рост и снизить потребность в посевных клетках.
В партии объемом 3 л конечный объем составлял 2 л при плотности посева 3×10⁴ клеток/мл. Клетки культивировали в течение 120 часов. Из-за различий в объёме количество клеток (а не их плотность) лучше отражало пролиферацию, демонстрируя увеличение в 10,4 раза (рис. 5). Тенденции изменения уровня питательных веществ и метаболитов показаны на рис. 6 и 7. Проточная цитометрия на 5-й день (рис. 8) показала, что клетки были CD90⁺, CD73⁺, CD19⁻ и HLA-DR⁻, что указывает на сохранение характеристик МСК.
4. Заключение
В ходе этого исследования был успешно разработан и проверен масштабируемый процесс культивирования МСК на основе 3D-микроносителей в биореакторах. Платформы биореакторов T&J CloudReady® и Opti-Cell mini® продемонстрировали гибкость в применении для культивирования прикреплённых или суспензионных клеток с высокой плотностью. Они поддерживают различные режимы процесса (периодический, периодический с подпиткой, перфузионный) и сочетаются с программным обеспечением D2MS, обеспечивающим стабильное и автоматизированное управление процессом.
Ссылки
[1] Мизуками, Аманда, Свич, Камилла. Мезенхимальные стромальные клетки: от
открытия до производства и коммерциализации. Стволовые клетки
International, 2018, 4083921.
[2] Т. Скуилларо, Г. Пелузо, У. Гальдеризи. Клинические исследования мезенхимальных стволовых клеток: обновлённая информация. Трансплантация клеток, 2016, 25(5): 829–848.
[3] Ф. Ф. душ Сантуш, П. З. Андраде, К. Л. да Силва, Ж. М. С. Кабрал.
Конструкция биореактора для размножения стволовых клеток клинического качества.
Биотехнологический журнал, 2013, 8(6): 644–654.
[4] П. А. Тозетти, С. Р. Карузо, А. Мизуками. Стратегии расширения культуры мезенхимальных стромальных клеток человека в бесксеногенных условиях. Прогресс в биотехнологии, 2017, 33(5): 1358–1367.