Аденоассоциированные вирусы (AAV) — это небольшие вирусы, геном которых состоит из одноцепочечной ДНК (4,7 кб), заключенной в вирусный капсид, сформированный из трёх белков (VP1, VP2 и VP3). Wild type AAV (природный, естественный) требует коинфекции с вирусом-помощником, таким как аденовирус (Ad), вирус простого герпеса или вирус оспы, для обеспечения продуктивной инфекции и репликации. При активной инфекции геном AAV сохраняется в ядре клетки-хозяина в эписомальной форме с устойчивой экспрессией РНК и может также интегрироваться в ДНК хозяина в хромосому 19.
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) используются в качестве векторов доставки ДНК для генной терапии человека, благодаря способности AAV инфицировать клетки человека, оставаясь при этом непатогенными. rAAV производятся и вводятся без использования какого-либо вспомогательного вируса, что снижает риск интеграции генома и обеспечивает этим векторам привлекательный профиль безопасности. Разнообразие серотипов rAAV обеспечивает специфичность доставки интересующего терапевтического гена (GOI) в целевые органы.
Спрос на AAV быстро растёт по мере расширения клинических программ и получения разрешений на применение новых методов генной терапии. Однако процесс производства AAV по-прежнему остаётся сложным и представляет собой серьёзную проблему с точки зрения масштабирования и достижения высоких выходов. Существует острая необходимость в поиске оптимальных условий, способствующих интенсификации процесса крупномасштабного производства AAV.
В настоящее время наиболее распространенным методом крупномасштабного производства rAAV является использование тройной трансфекции в клетках HEK293, культивируемых в суспензии, с последующей очисткой.
Транзиторная трансфекция в производстве rAAV
Производство rAAV обычно включает химическую трансфекцию плазмидной ДНК, доставляющей генетический материал в клетки HEK293. Клеточные механизмы перенаправляются для обеспечения синтеза вирусных белков, необходимых для образования новых частиц rAAV, несущих терапевтический генетический объект интереса (GOI). Для производства rAAV наиболее распространенный метод требует котрансфекции трех плазмид: одного трансгена, кодирующего терапевтический GOI, и двух упаковочных плазмид, каждая из которых обеспечивает определенные функции, как описано ниже
Трансген: содержит ген интереса (GOI), обеспечивающий терапевтический эффект, — окруженный двумя ITR для обеспечения его экспрессии в клетке-хозяине; pRep/Cap: кодирует белки, необходимые для вирусной репликации (белки Rep), структуры капсида (VP1, VP2, VP3) и вспомогательные белки (AAP, MAAP); pHelper: кодирует «вспомогательные» функции, необходимые для вирусной репликации
Поскольку естественные AAV требуют коинфекции с вирусом-помощником для обеспечения продуктивной инфекции и репликации, плазмида-помощника — содержащая гены, необходимые для поддержки репликации и инкапсуляции rAAV — трансфицируется вместе с плазмидой Rep/Cap. Сочетание обеих плазмид необходимо для успешной «упаковки» GOI в вирусные частицы.
Вспомогательная плазмида, как правило, содержит ключевые аденовирусные гены, необходимые для репликации rAAV (РНК E1A/B, E2A, E4 и VA). Однако известно, что в качестве хелперных вирусов для ААВ дикого типа могут выступать и другие вирусы, такие как вирус простого герпеса (HSV) или человеческий бокавирус (HboV).