Вы по-прежнему сталкиваетесь с низкой эффективностью переноса и нечеткими показателями при проведении вестерн-блоттинга? Вы повторяли эксперименты, меняли антитела, варьировали их концентрацию, корректировали время воздействия, но результаты были все равно неудовлетворительные?
Прежде чем сомневаться в своих антителах или в технике проведения эксперимента, подумайте вот о чем: при вестерн-блоттинге результат последующей детекции часто зависит от того, насколько стабильно и равномерно белки переносятся на мембрану. В этом процессе тип и размер пор передающей мембраны, а также совместимость фильтровальной бумаги для блоттинга напрямую влияют на эффективность переноса и качество результата.
Материал мембраны: нейлон или поливинилиденфторид?
В вестерн-блоттинге чаще всего используются два типа мембранных материалов: нитроцеллюлоза (НЦ/NC) и поливинилиденфторид (ПВДФ/PVDF). Ниже приведены их основные различия при использовании в вестерн-блоттинге.
Таким образом:
мембрана NC идеально подходит для традиционных и разовых анализов методом вестерн-блоттинга.
Мембрана из поливинилиденфторида лучше подходит для обнаружения белков в малых количествах, многократных стриппинг-анализов и высокочувствительных исследований.
Размер пор мембраны: 0,45 мкм или 0,2 мкм?
Помимо материала, не менее важен размер пор. Обычные белки, такие как β-актин и глицеральдегидфосфатдегидрогеназа, обычно хорошо переносятся на мембраны с размером пор 0,45 мкм, в то время как мембраны с размером пор 0,2 мкм специально разработаны для низкомолекулярных белков.
Компания Cobetter и Alianbio предлагают высокоэффективные мембраны для переноса из PVDF с размерами пор 0,2 мкм и 0,45 мкм, обеспечивающие высокую чувствительность, эффективный перенос белка, более высокое разрешение полосы пропускания и надежное обнаружение малочисленных объектов.
Выбор бумажных фильтров
В комплексе для переноса в вестерн-блоттинге промокательная фильтровальная бумага является одним из основных компонентов, обеспечивающих равномерность переноса.
Основные функции промокательной фильтровальной бумаги:
- создание равномерного давления для обеспечения плотного контакта между гелем и мембраной и предотвращения неравномерного переноса;
- создание буферного резервуара для поддержания постоянной проводимости и стабилизации электрического поля;
- предотвращение образования пузырьков воздуха — высококачественная промокательная фильтровальная бумага обеспечивает плотное прилегание, сводя к минимуму образование пузырьков.
Высококачественная промокательная фильтровальная бумага обычно изготавливается из волокон высокой степени очистки и отличается равномерной толщиной, высокой впитывающей способностью и хорошей механической прочностью. В продаже можно найти промокательную фильтровальную бумагу разной толщины — от ультратонкой до очень плотной.
Cobetter предлагает два вида предварительно нарезанных высококачественных фильтровальных бумаг из хлопковой целлюлозы: ультратонкие (0,38 мм) и стандартные (0,8 мм) с идеально ровной поверхностью. Размер 7,5 × 8,4 см подходит для большинства коммерческих переливных емкостей, обеспечивая удобство и эффективность использования.
Заключение
На практике для эффективного и равномерного переноса белка важно правильно подобрать тип мембраны и размер пор в зависимости от молекулярной массы и количества целевого белка, а также от требований эксперимента. В сочетании с высококачественными фильтровальными бумагами для блоттинга можно еще больше повысить эффективность переноса и четкость полос, что в конечном итоге позволит получать более стабильные и надежные результаты в экспериментах по вестерн-блоттингу.