Научный подход и инновационное применение: глубокая интеграция перфузионного культивирования с технологией Cobetter ATF

В связи с резким ростом спроса на биофармацевтическую продукцию и повсеместным внедрением концепции «Качество через проектирование» (QbD) традиционные методы культивирования (fed-batch) больше не способны удовлетворить все более строгие требования биофармацевтических компаний в отношении контроля затрат и гибкости производства. Перфузионное культивирование, как наиболее эффективная технология культивирования клеток, постепенно стала основным направлением интенсификации производственных процессов в отрасли благодаря своим значительным преимуществам: высокой плотности клеток, высокой производительности и сокращенному времени обработки.

Основные проблемы процессов перфузии заключаются в стабильности удержания клеток высокой плотности, точном контроле гидродинамики, обеспечении долгосрочного культивирования и возможности масштабирования производства. Продукты серии Cobetter ATF, основанные на технологии фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF) и использующие мембраны из полых волокон, системно решают эти проблемы, обеспечивая комплексную поддержку процессов перфузии.

По сравнению с периодическим культивированием Fed-Batch, процесс перфузии обладает значительными преимуществами:

1. Более высокая плотность жизнеспособных клеток и производительность на единицу объема: пиковая плотность жизнеспособных клеток в перфузионной культуре, как правило, в несколько раз превышает аналогичный показатель при использовании метода Fed-Batch, что позволяет значительно повысить эффективность производства на единицу объема.

2. Более высокое качество продукции: процесс перфузии позволяет в течение длительного времени поддерживать благоприятную среду культивирования, эффективно снижая уровень клеточного метаболического стресса, при этом значительно уменьшая накопление вредных побочных продуктов метаболизма, таких как лактат и аммиак, что обеспечивает стабильность ключевых показателей качества конечного продукта от партии к партии.

3. Контролируемые экономические затраты: хотя расход среды в перфузионном процессе выше, его способность значительно увеличить выход одной партии означает, что, особенно в популярных в настоящее время процессах IFB или IPFB, стоимость реагентов и ключевых расходных материалов, требуемых на грамм продукта, фактически сопоставима со стоимостью в процессах с периодической подачей питательной среды или даже ниже.

4. Сокращение цикла разработки и производства: для продуктов с низким уровнем экспрессии в отдельной клетке или низкой стабильностью продукта использование перфузионного процесса для начальной экспрессии может эффективно сократить цикл разработки процесса и ускорить ход проекта.

1. Интенсифицированный метод Fed-batch (IFB): как правило, с использованием фильтрационного модуля с размером пор 0,2 мкм, при этом сохраняя основной принцип традиционного процесса Fed-batch без изменений, применение технологии усиления перфузии на этапе N-1 позволяет эффективно сократить длительность подготовительного цикла и значительно увеличить начальную плотность инокулята, а также пиковую плотность жизнеспособных клеток на этапе N. Оптимизируя подачу питательных веществ и контроль метаболизма в процессе культивирования, можно значительно повысить выход на единицу объема и эффективность производства.

2. Периодическая перфузионная fed-batch (IPFB) и концентрированная fed-batch (CFB): На основе традиционных процессов Fed-Batch или IFB с использованием фильтрационного модуля 50 кДа целевой продукт и клетки удерживаются в биореакторе, а замена среды осуществляется непрерывно или периодически. Это позволяет поддерживать высокую плотность клеток и высокую жизнеспособность, значительно увеличивая выход одной партии и обеспечивая качество продукта. Питательная среда добавляется по мере необходимости во время культивирования, а сбор клеток осуществляется полностью в конце культивирования.

3. Непрерывная перфузия (CPC): как правило, с использованием фильтрационного модуля 0,2 мкм клетки удерживаются в биореакторе, в то время как свежая среда непрерывно добавляется в биореактор со скоростью, соответствующей объему культуры, а супернатант, содержащий продукт, удаляется. Клетки могут периодически удаляться, если это необходимо для поддержания определенной плотности и жизнеспособности клеток, что позволяет продлить период культивирования до нескольких недель или даже месяцев и достичь.

Успешный процесс перфузии не возникает в одночасье; на этапе его разработки необходимо тщательно учитывать следующие аспекты:

1. Выбор решения для удержания клеток

Устройство для удержания клеток является основным элементом процесса перфузии. К типичным компонентам, используемым для реализации процессов перфузии, относятся ротационные мембранные фильтры, системы осаждения и системы тангенциальной фильтрации. В настоящее время устройства, основанные на принципе фильтрации с использованием полых волокон, стали основным направлением в отрасли, среди которых наиболее типичными являются технологические схемы ATF (Alternating Tangential Flow) и TFF (Tangential Flow Filtration).

Подробное сравнение двух основных технологических схем приведено в таблице 1.

Таблица 1. Сравнение ATF и TFF

2. Ключевой параметр процесса: уровень перфузии

Скорость перфузии на клетку (CSPR) является наиболее важным проектным параметром в процессах перфузии, отражающим объем культуральной среды, необходимый на одну клетку в сутки. Определение минимальной CSPR (CSPRmin) имеет решающее значение для оптимизации эффективности использования среды и снижения затрат. Если CSPR слишком низкая, это приводит к недостаточному снабжению питательными веществами; напротив, чрезмерно высокая CSPR может вызвать ненужные затраты и увеличить нагрузку на последующие этапы очистки. Рекомендуется поддерживать CSPR на как можно более низком уровне, ниже 50 пл/клетка·день.

3. Оптимизация культуральной среды

В процессах перфузии базовая среда часто оказывается недостаточной для поддержания роста клеток сверхвысокой плотности. Исследования показали, что добавление питательной среды (такой как Feed A/B) во время перфузии может непосредственно удвоить плотность жизнеспособных клеток с 40×10^6 клеток/мл до 80×10^6 клеток/мл, при этом скорость роста на одну клетку увеличивается примерно на 230%.

4. Масштабирование и его эффект

Масштабирование с лабораторного масштаба до 2000 л или даже более крупного промышленного производства требует обеспечения того, чтобы соотношение площади мембраны колонки с полыми волокнами к объему культуры оставалось в разумных пределах для контроля теоретического сдвига на конце рециркуляции и значений трансмембранного потока.

Исходя из вышеизложенной логики выбора, продукты серии Cobetter XperCell™ ATF специально разработаны для решения ключевых проблем и предоставляют надежные решения в области компонентов для систем ATF для клиентов из биофармацевтической отрасли как на внутреннем, так и на международном рынке. Подробная информация о продуктах приведена в таблице 2.

1. Превосходная основа: половолоконные мембраны из PES

Основное преимущество серии Cobetter XperCell™ ATF заключается в половолоконных мембранах из полиэфирсульфона (PES) собственного производства.

Низкий уровень экстрагируемых веществ и хорошая совместимость с клетками: материал PES имеет низкий уровень экстрагируемых веществ и меньший риск попадания потенциальных примесей во время биопереработки, что обеспечивает безопасную среду для роста клеток.

Точное удержание: Cobetter предлагает различные варианты размера пор (например, 50 кДа, 0,2 мкм) для разных продуктов (таких как моноклональные антитела, рекомбинантные белки, вакцины), эффективно удерживая клетки или продукты и одновременно обеспечивая плавный слив продуктов или метаболических отходов.

2. «Надежный исполнитель» для стерилизации высокотемпературным паром

Серия ATF из нержавеющей стали Cobetter обладает хорошей термостойкостью и выдерживает стандартные процедуры стерилизации высокотемпературным паром, обеспечивая высокий технологический поток и целостность мембраны после многократных стерилизаций. Все продукты стерилизуются высокотемпературным паром и проходят испытания на целостность перед отпуском, чтобы гарантировать отсутствие риска утечки после стерилизации.

3. Удобство в эксплуатации и гибкость

Одноразовые системы серии ATF от Cobetter отличаются удобством в эксплуатации. Метод хранения с предварительным увлажнением позволяет эффективно сохранить структуру пор мембраны, а для промывки мембранной колонки перед использованием требуется лишь небольшое количество стерильной очищенной воды или воды для инъекций. Серия одноразовых ATF охватывает размеры пор 0,2 мкм и 50 кДа, удовлетворяя потребности в удобстве эксплуатации на разных этапах технологического процесса заказчика.

4. Широкие возможности масштабирования и услуги по индивидуальной настройке

Независимо от того, находитесь ли вы на этапе НИОКР или коммерциализации, Cobetter может предоставить подходящее решение:

Широкий диапазон масштабов: в настоящее время продукты подходят для масштабов культивирования клеток от 1 л до 2000 л.

Индивидуальная разработка: для особых технологических требований Cobetter предоставляет услуги по адаптации продуктов, гибко подстраиваясь под различные конфигурации биореакторов и цели технологического процесса.

5. Строгий контроль качества
В биофармацевтической сфере безопасность всегда на первом месте. Продукты Cobetter ATF производятся в чистой среде класса ISO 7 и перед отправкой с завода проходят 100% проверку целостности и тестирование водного потока.

Каждый отгружаемый компонент сопровождается подробной документацией по качеству, что соответствует требованиям биофармацевтических клиентов в области безопасности производства и аудита, а также помогает клиентам в подаче заявок в соответствии с нормативными требованиями.

Таблица 2. Информация о продуктах серии Cobetter XperCellTM ATF

Будущее уже наступило: от интенсифицированных процессов к непрерывному производству

Благодаря постоянному развитию технологий перфузионного культивирования их применение больше не ограничивается экспрессией нестабильных белков. В сфере производства моноклональных антител интенсифицированные процессы, включающие N-1-усиление перфузии и удержание продукта на N-этапе (IFB, IPFB и CFB), становятся мощными инструментами для повышения выхода продукта. Благодаря внедрению перфузии на стадии N-1 можно получить исходные клетки в фазе логарифмического роста с плотностью до 100×10^6 клеток/мл или даже выше. На этапе экспрессии N-стадии использование мембранных колонок 50 кДа позволяет достичь двойной цели: удалить продукты обмена веществ и при этом эффективно удержать целевой продукт. Применение подобных интенсифицированных процессов может значительно сократить производственные циклы и повысить коэффициент использования производственных мощностей.

В таких интенсифицированных процессах и даже в будущих полностью непрерывных производственных процессах система ATF является не только инструментом для удержания клеток, но и мостом, соединяющим операции на начальных и конечных этапах. Продукты Cobetter ATF с полыми волокнами, благодаря своей стабильной производительности и надежному качеству, помогают фармацевтическим компаниям преодолевать технологические барьеры интенсификации процессов, обеспечивая переход от «следования» к «согласованию темпа».