При очистке антител аффинная хроматография почти всегда является первым этапом процесса. При выборе аффинных сорбентов «связывающая способность» обычно является основным параметром, о котором говорят — и тем, который чаще всего переоценивают: «Этот сорбент обеспечивает DBC 60 г/л». «А у той — даже выше». Звучит привлекательно и понятно.
Однако всегда ли в реальных промышленных процессах более высокая связывающая способность лучше? Ответ прост: не обязательно. Во многих случаях ответ даже на самом деле — НЕТ.
Почему всегда подчеркивается «высокая связывающая способность»?
Динамическая связывающая способность (DBC) — это, безусловно, важный параметр.
Она напрямую определяет:
• какое количество антител может вместить колонка
• какой объем материала можно обработать за один цикл
• требуются ли колонки большего размера
Поскольку в процессах предварительной очистки с высоким титром концентрация обычно достигает 5–10 г/л и более, нагрузка на требования к последующим этапам производства усилилась. Если сорбент не справляется с нагрузкой, приходится использовать более крупные колонки или увеличивать количество циклов.
Именно поэтому высокая емкость стала одним из главных аргументов в маркетинге сорбентов. Однако проблема заключается в том, что связывающая способность — это лишь один из факторов, в то время как промышленное производство представляет собой комплексную задачу.
Емкость и пропускная способность часто находятся в противоречии друг с другом
С технической точки зрения существует вполне реальный компромисс: во многих случаях более высокая связывающая способность достигается за счет снижения скорости работы.
Для обеспечения более высокой производительности сорбенты часто требуют:
• более высокой плотности лигандов
• более сложной и глубокой структуры пор
Это приводит к прямому следствию: увеличению сопротивления массопереносу. Другими словами, если скорость потока недостаточно низкая:
• белки не имеют достаточного времени для диффузии в поры
• заявленная высокая связывающая способность не может быть полностью реализована
В результате сорбенты с высокой связывающей способностью часто требуют:
• более длительного времени обработки
• более низких скоростей потока
• значительно более длительных циклов
Напротив, сорбенты с умеренной связывающей способностью часто обеспечивают более высокую общую производительность. Причины этого следующие:
• увеличенная жесткость гранул
• структура пор, более благоприятная для быстрого массообмена
• возможность работы при более высокой линейной скорости и большей высоте слоя
Поэтому, если более высокая связывающая способность достигается за счет скорости потока и длительности цикла, это может оказаться нерентабельным.
Способность связывания должна соответствовать уровню экспрессии
Еще один вопрос, который часто упускают из виду, заключается в том, можно ли на самом деле полностью использовать связывающую способность.
◉ Низкий или умеренный уровень экспрессии
Если титр в предыдущем этапе невысок (например, <2–3 г/л), полная загрузка аффинной колонки с высокой емкостью будет означать:
• чрезвычайно длительное время загрузки
• продленное время выдержки материала для сбора при комнатной температуре или в охлажденном состоянии
Это не только вопрос эффективности, но и фактор риска. В таких случаях затраты на «высокую емкость» не приносят реальной пользы для процесса.
◉ Высокие уровни экспрессии
Когда титры на этапе upstream уже высоки (>5 г/л), сорбенты с высокой емкостью начинают демонстрировать свои истинные преимущества, позволяя уменьшить объем колонки или количество циклов и устранить узкие места на этапе downstream.
В отношении связывающей способности не всегда верно, что чем выше, тем лучше; важно, чтобы она была правильно подобрана с учетом уровней экспрессии на этапе upstream.
Более высокая связывающая способность не всегда означает лучшую селективность
Об этом редко говорят в маркетинге, но в разработке технологических процессов это очень актуально. Когда сорбент работает на пределе своей пропускной способности, могут наблюдаться следующие явления:
• антитела начинают плотно заполнять поры
• примеси (HCP, ДНК, агрегаты) могут физически задерживаться
• эффективность промывки снижается
В результате:
• кажущаяся связывающая способность высока
• но чистота элюата снижается
• на последующих этапах (инактивация вирусов, фильтрация) возникает повышенная нагрузка
Кроме того, чрезвычайно высокая связывающая способность часто приводит к очень высоким концентрациям элюата:
• концентрация элюционного буфера может достигать 50–80 мг/мл
• увеличивается вязкость
• повышается риск агрегации
Если более высокая емкость приводит к снижению чистоты, увеличению риска и большим трудностям на последующих этапах, то с точки зрения технологического процесса такая емкость, по сути, «завышена».
Связывающая способность и срок службы — это две стороны одной медали.
Нельзя не учитывать тот факт, что сорбенты используются не один или два раза — от них ожидают многолетней службы и сотен циклов.
Для достижения максимальной связывающей способности некоторые сорбенты могут:
• использовать более агрессивные стратегии соединения лигандов
• подвергаться более сильным химическим и механическим нагрузкам на структурном уровне
При многократной очистке NaOH (CIP) это может привести к:
• более быстрому разложению лигандов
• более быстрой потере емкости с течением времени
• сокращению срока службы сорбента
В промышленном производстве любое сокращение срока службы в конечном итоге отразится на себестоимости продукции (CoG).
Более практичный подход к выбору сорбентов
При выборе сорбента для реальных промышленных условий связывающую способность следует оценивать в более широком контексте:
• Какова полезная связывающая способность при заданной скорости потока и высоте слоя?
• Какова производительность (г/л/ч) при заданном количестве циклов?
Сколько циклов можно стабильно провести при заданных условиях CIP?
• Снижает ли это общую сложность процесса?
• В этих рамках становится ясна роль связывающей способности: это порог, а не конечная цель.
Как только связывающая способность достигает «достаточного» уровня, дополнительные 3–5 г/л часто менее ценны, чем:
• более высокие расходы
• более стабильный срок службы
• более надежное общее технологическое окно
Заключение
Стремление к высокой связывающей способности само по себе не является ошибкой. Настоящий вопрос заключается в том, применяется ли она правильно и в рамках подходящего технологического процесса.
При выборе аффинного сорбента для антител взвешенное решение заключается не в том, какой сорбент обладает наибольшей связывающей способностью, а в том, какой из них позволяет наилучшим образом сбалансировать связывающую способность, скорость, стабильность и срок службы в реальных технологических условиях.
Именно это имеет истинное значение с промышленной точки зрения.