Регулирование уровня метанола для усиления экспрессии Pichia pastoris с использованием параллельного биореактора CloudReady, интегрированного с масс-спектрометром

Системы Pichia pastoris, индуцируемые метанолом, требуют точного контроля подачи метанола для оптимизации экспрессии рекомбинантных белков. В данном исследовании представлена интегрированная платформа для онлайн-мониторинга процесса культивирования, использующая масс-спектрометр Hiden DECRA в сочетании с системой параллельных биореакторов CloudReady® объемом 1,5 л с четырехкратной параллельной конфигурацией от TJX Bioengineering.

Платформа обеспечивает автоматическое регулирование за счет многоканального детектирования и обратной связи в режиме реального времени. Благодаря возможности моделирования, сравнению показателей ферментации и многоканальной демонстрации было доказано, что система повышает биомассу (OD600 нм, влажный вес), выход белка, точность подачи метанола и степень автоматизации. Результаты демонстрируют, что интеграция масс-спектрометрии в процесс ферментации может оптимизировать управление процессом и эффективность производства, имея большой потенциал для широкого применения.

Pichia pastoris широко известна своей способностью к индуцируемой метанолом экспрессии рекомбинантных белков, что делает её предпочтительным выбором для производства вакцин, ферментов и терапевтических белков благодаря высокой эффективности экспрессии и посттрансляционным модификациям. Метанол выполняет двойную роль в процессе ферментации — выступает одновременно в качестве источника углерода и индуктора. Точный контроль подачи метанола имеет решающее значение, поскольку избыток метанола может быть токсичным и ингибировать рост, в то время как его недостаток может привести к недостаточной индукции.

Обычные стратегии подачи метанола часто основываются на динамике содержания растворенного кислорода (DO) или на заранее заданном дозировании с фиксированным временем и фиксированным объемом. Эти подходы страдают от значительных задержек и в значительной степени зависят от ручного вмешательства, что затрудняет точный контроль динамических концентраций метанола. Для решения этих задач в данном исследовании интегрирована система онлайн-газового масс-спектрометра Hiden для обнаружения метанола в отходящем газе в режиме реального времени. В сочетании с 4-кратной параллельной системой биореакторов TJX и логикой управления на основе пользовательских функций (UDF) была разработана комплексная мультиреакторная платформа для высокочастотной обратной связи и автоматической подачи метанола. Экспериментальная валидация продемонстрировала ее преимущества в точности управления, эффективности экспрессии и снижении общих производственных затрат.

Платформа мониторинга и управления с интегрированной масс-спектрометрией была создана с использованием следующих приборов (рис. 1):
(1) Четырехканальный параллельный биореактор CloudReady® объемом 1,5 л с программным обеспечением Device and Data
Management System (D2MS), версия 2.10.36.3 (TJX Bioengineering)
(2) Масс-спектрометр (DECRA, Hiden Analytical) с программным обеспечением для количественного анализа газов
(QGA)
(3) Многоканальный модуль переключения газов (TJX Bioengineering)
(4) Биохимический анализатор (Cell-Gene, CG220)

Рисунок 1. Интеграция параллельного биореактора CloudReady® объёмом 1,5 л с
масс-спектрометром Hiden

2.2.1 Платформа интеллектуального управления
С помощью D2MS v2.10.36.3 данные QGA были интегрированы и визуализированы в режиме реального времени, что позволило создать универсальную платформу для сбора данных, настройки параметров и управления с обратной связью. Как показано на рисунке 2, интерфейс D2MS поддерживает визуализацию параметров ферментации и данных по отходящим газам в режиме реального времени, многоканальное переключение по времени, комбинации модульных биореакторов и мониторинг состояния каналов для интегрированного управления данными.

Рисунок 2. Пользовательский интерфейс программного обеспечения управления D2MS

2.2.2 Оптимизация газовой линии
Для сокращения времени отклика системы и отбора проб масс-спектрометра исходная конфигурация с высокоточным регулятором массового расхода (MFC) для малых расходов была заменена на комбинацию Т-образного соединителя и встроенного фильтра (рис. 3). Т-образный соединитель и фильтр были соединены с помощью трубки с внутренним диаметром 1/16 дюйма с 45° скошенным входом и увеличенной длиной для уменьшения расхода газа.

Рисунок 3. Конфигурация газовой линии с Т-образным соединителем и разделением потока

2.2.3 Автоматическое регулирование подачи метанола
С помощью UDF в D2MS была построена кривая градиента концентрации для осуществления управления по замкнутому циклу между измеренными уровнями метанола в отходящих газах (0–40 ппм) и скоростями подачи (1,5–15 мл/ч). Определение концентрации метанола в отходящих газах в режиме реального времени запускает управление UDF для динамической регулировки скоростей подачи, поддерживая концентрацию ниже 40 ппм.

2.3.1 Калибровка холодной модели
Метанол (0–60 г/л) постепенно добавляли в биореактор, содержащий 600 мл очищенной воды, при параметрах: температура 20 °C, скорость перемешивания 1200 об/мин и аэрация 1,5 л/мин. Содержание метанола в отходящем газе контролировалось с помощью масс-спектрометра Hiden DECRA, а концентрация метанола в жидкой фазе измерялась с помощью биохимического анализатора Cell-Gene. Была построена модель корреляции 6 концентраций в газовой и жидкой фазах (R2 > 0,99). Для калибровки диапазона чувствительности масс-спектрометра использовалась сегментная линейная регрессия, обеспечивающая линейную точность по всему диапазону измерений.

2.3.2 Валидация одноканальной системы
В этом эксперименте оценивались скорость отклика в реальном времени и точность определения концентрации газа в системе с интегрированным масс-спектрометром, работающей в одноканальном режиме. Исследование включало экспериментальную группу с анализом отходящих газов и контрольную группу без анализа газов. Отбор проб проводился на специальном биореакторе, отходящие газы которого разделялись через Т-образный соединитель с уравновешенным давлением как на масс-спектрометр Hiden, так и на газоанализатор TJX для одновременных измерений. Выходные данные обоих устройств сравнивались с помощью платформы D2MS-QGA для оценки согласованности и задержки отклика. Скорость подачи метанола регулировалась вручную (1,5– 15 мл/мин), и регистрировались соответствующие изменения концентрации метанола и времени отклика системы, при этом уровень метанола в выхлопных газах поддерживался ниже 40 ppm.

2.3.3 Проверка многоканального управления с обратной связью
Для проверки эффективности управления с замкнутым контуром интегрированной системы с масс-спектрометром в многоканальном режиме расход входного газа в масс-спектрометр ограничивали с помощью манипулятора расхода газа (MFC), а концентрацию метанола в отходящих газах (поддерживаемую на уровне ниже 40 ppm) использовали в качестве сигнала обратной связи для ручной регулировки скорости подачи метанола. Во время ферментации образцы отбирались каждые 24 часа для измерения влажного веса ячейки, общего содержания белка (по методу Брэдфорда) и концентрации остаточного метанола.

2.3.4 Проверка стабильности многоканальной системы и автоматического управления
Этот эксперимент был посвящен долгосрочной стабильности системы и автоматическому управлению в системе с интегрированным масс-спектрометром в режиме непрерывной работы. Система была настроена на активный отбор проб через Т-образный разветвитель, при этом концентрация метанола в отходящих газах в реальном времени (поддерживаемая на уровне ниже 40 ppm) использовалась для запуска управления UDF. Это обеспечивало непрерывное регулирование скорости подачи метанола по замкнутому контуру. В ходе эксперимента в первую очередь отслеживались дрейф данных, точность управления и стабильность отклика в течение длительных периодов автоматической работы. Каждые 24 часа отбирались пробы для измерения массы влажной клетки, общего содержания белка (по методу Брэдфорда) и концентрации остаточного метанола.

3.1 Испытания холодной модели
Как показано на рисунке 4, была обнаружена сильная положительная корреляция между концентрацией метанола в жидкой фазе и сигналом метанола в отходящем газе, регистрируемым масс-спектрометром. В диапазоне 0–14 г/л была установлена значимая линейная зависимость с коэффициентом корреляции
(R2) превышающим 0,99, что указывает на пригодность для количественного моделирования и калибровки чувствительности. При концентрации выше 20 г/л кривая отклика отклонялась от линейности и приближалась к насыщению. На этом основании была разработана модель корреляции жидкость–газ,
обеспечивающая надежную основу для онлайн-детекции и управления по замкнутому циклу.

Рисунок 4. Модель взаимосвязи «жидкость–газ», построенная на основе результатов холодных модельных испытаний с метанолом

3.2 Одноканальный тест
На рисунке 5 показано, что биомасса увеличилась как в экспериментальной, так и в контрольной группах до 92 ч, хотя в экспериментальной группе рост был ниже. К 116 ч экспериментальная группа превзошла контрольную, а к 166 ч её OD600 нм увеличилась на 60,1 %, а масса влажной клетки — на 41,8 %, что свидетельствует о значительном преимуществе в росте. Эти результаты подтверждают, что мониторинг отходящих газов эффективно
способствовал накоплению биомассы. Как показано на рисунке 6, данные по отходящим газам, полученные с помощью
масс-спектрометра Hiden, совпадали с измерениями анализатора отходящих газов TJX, что свидетельствует о высокой надежности.

Рисунок 5. Результаты одноканальной ферментации

Рисунок 6. Сравнение результатов измерения отходящих газов, полученных с помощью масс-спектрометра Hiden
и анализатора отходящих газов TJX

3.3 Оптимизация многоканальной подачи с помощью ручного управления по обратной связи

В условиях ограничения по MFC отходящие газы из каждого биореактора последовательно направлялись в масс-спектрометр с интервалом в 30 минут с помощью модуля многоканального переключения. Скорости подачи метанола регулировались вручную на основе данных обратной связи о концентрации метанола в отходящих газах. На рисунке 7 показано, что конечный выход общего белка в четырех биореакторах составил 9360,82, 8479,99, 8607,31 и 9167,33 мг соответственно, при среднем выходе 8903,86 мг (относительное стандартное отклонение, RSD = 4,79%). Это представляет собой увеличение на 11,3 % по сравнению с одноканальным режимом (8000,26 мг), при максимальном улучшении на 16,99 %. Эти результаты указывают на то, что данная стратегия не только повысила эффективность экспрессии белка и надежность системы, но и продемонстрировала практичность и эффективность многоканального модуля переключения в процессах ферментации.

Рисунок 7. Результаты многоканального мониторинга отходящих газов в условиях,
ограниченных MFC

3.4 Многоканальная оптимизация с помощью автоматического управления с обратной связью

Как показано на рисунке 8, при автоматическом управлении общий выход белка в четырёх биореакторах через 188 часов составил 16 843,80, 17 479,99, 17 952,49 и 17 054,86 мг соответственно, при этом средний выход составил 17 332,79 мг (RSD = 2,83 %). Это представляет собой увеличение на 94,7% по сравнению с режимом ручного управления (8 903,86 мг) и на 117,9% по сравнению с группой с одноканальным управлением (7 955,41 мг). Благодаря использованию системы, интегрированной с масс-спектрометром, для мониторинга концентрации метанола в отходящих газах в режиме реального времени и запуска пользовательской функции (UDF) для автоматической регулировки подачи, удалось успешно реализовать непрерывное управление с замкнутым контуром. Результаты демонстрируют, что режим автоматического управления обеспечивает как высокую стабильность (RSD < 3%), так и точность при длительной работе, подтверждая его двойное преимущество в повышении экспрессии белка и надежности процесса.

Рис. 8. Экспрессия белка при многоканальном автоматическом контроле отвода газа с помощью Т-образного соединителя

В ходе этого исследования была проведена систематическая оценка эффективности системы с интегрированным масс-спектрометром в условиях многоканального автоматического управления. На основе экспериментальных данных и результатов управления были сделаны следующие ключевые выводы и определены области применения:
1. Повышенная точность обратной связи. Внедрение масс-спектрометрии позволило в режиме реального времени отслеживать отходящие газы, что значительно повысило точность управления обратной связью по концентрации метанола. Это позволило более чутко и оперативно регулировать подачу метанола во время ферментации, что подчеркивает важнейшую роль системы с интегрированным масс-спектрометром в оптимизации процесса.
2. Высокопроизводительное многоканальное управление. Успешная реализация многоканального коммутационного модуля позволила
осуществлять последовательный отбор проб для мониторинга метанола в отходящих газах и управления подачей сырья на основе обратной связи в нескольких биореакторах. В результате различия в экспрессии белков в четырех биореакторах оставались в пределах допустимой погрешности (RSD = 4,79 %), что свидетельствует о высокой производительности системы управления с обратной связью и хорошей воспроизводимости многоканального режима.
3. Стабильная автоматизация по замкнутому циклу. Благодаря интеграции автоматизированного управления с помощью пользовательской функции (UDF) система обеспечивает стабильное регулирование по замкнутому циклу в течение длительного времени эксплуатации. Это снизило норматив выхода белка
до 2,83%, что на 40,8% меньше по сравнению с ручным управлением, при одновременном увеличении выхода на 94,7%. Автоматизация эффективно
устранены колебания, вызванные ручной регулировкой, что подчеркивает преимущество автоматизированного управления в повышении эффективности ферментации.
4. Стабильность при непрерывной ферментации с высокой плотностью. При длительной непрерывной работе система продемонстрировала превосходную стабильность, эффективность и точность. Она обеспечила точную и безопасную подачу метанола при ферментации с высокой плотностью загрузки и в условиях управления несколькими биореакторами, что позволило оптимизировать процессы ферментации и эффективно управлять производством.
5. Потенциал применения в биотехнологиях. Благодаря автоматизированному управлению, многоканальной обратной связи и стабильности системы эта платформа обладает большим потенциалом для широкого применения в экспериментальных исследованиях, оптимизации производства и ферментации в промышленных масштабах. В будущем можно будет внедрить многопараметрические механизмы обратной связи и распространить их на другие системы индукции субстратов, что позволит еще больше усовершенствовать интеллектуальные платформы для биопроизводства.

Ссылка
[1] Карбалеус, М. и эл. (2020). Пастор Пичиа: очень удачное выражение система для оптимального синтеза гетерологичных белков. Журнал клеточной биологии
физиология, 235 (9), 5867-5881.
[2] Хуан Т. и эл.. (2022). [Анализ экспрессии, очистки и биологической активности из рекомбинантного слитого белка Rhsa-Hfgf21 в Доме пастора. Шэн Ву
Гун Чэн Сюэ Бао, 38(9) лет: 3419-3432.
[3] Пэн Кью.Q. и эл. (2019). Гетерологичная экспрессия ингибитора инсулина в Новоиспеченный пастор Пичия. Китайский Журнал Биоинженерии, 39(7): 48–55.
[4] Лю, ТУАЛЕТ. и эл. (2016). Увеличение масштабов ферментации Пастор-Пичии новая стратегия производства метанола и увеличение масштабов
давление воздуха вместо добавок чистого кислорода. Научный представитель 6, 18439.
[5] Дин Дж., (2024). Усиление спорообразования Bacillus licheniformis с помощью автоматическая подача АЗОТА на основе онлайн-определения содержания CO2 в отходящих ГАЗАХ. Айше И. 2024; 70(1): e18255.