Удаление агрегатов | Использование гидрофобного сорбента при очистке биспецифических антител

Биспецифические антитела (bsAbs) — это искусственно созданные IgG, способные распознавать два эпитопа на одном или нескольких антигенах. Способность к двойному таргетированию делает их более предпочтительными по сравнению с традиционными моноклональными антителами (mAbs), что открывает широкие перспективы для лекарственной терапии.

Первый препарат на основе bsAb, катумаксомаб, был выведен на рынок в 2009 году. Препарат нацелен на CD3 и EpCAM и используется для лечения злокачественного асцита. Несмотря на то, что в 2013 году он был выведен с рынка, с тех пор препараты на основе bsAb быстро развиваются. В 2023 году более 200 молекул биспецифических антител проходят более 300 клинических испытаний по всему миру. Из них около 75% нацелены на солидные опухоли, а 25% — на гематологические злокачественные новообразования. К концу 2025 года на рынок было выпущено в общей сложности 19 препаратов на основе bsAb.

С точки зрения структуры bsAb можно разделить на bsAb без Fc-фрагмента (Non IgG-like BsAb) и bsAb, содержащие Fc-фрагмент. Последние бывают симметричными и асимметричными. Среди них асимметричные bsAb имеют четыре различных цепи (две цепи HC и две цепи LC), что увеличивает вероятность несовпадения и, следовательно, приводит к образованию большого количества побочных продуктов. Для симметричных bsAb содержание агрегатов значительно увеличилось, несмотря на низкий уровень побочных продуктов, которые могут образовываться в результате межмолекулярного обмена доменами, вызванного увеличением длины и гибкости цепей. Поэтому эффективная удаление примесей, включая нежелательные продукты и агрегаты, становится ключевой задачей на этапе последующей очистки моноклональных антител.

Гидрофобная хроматография (HIC) широко используется на downstream этапах благодаря своей способности эффективно удалять агрегаты из антител.

Агрегаты — один из видов примесей, который обязательно контролируют в ходе производства антител. От него напрямую зависит показатель качества и чистоты продукта.

Принцип: на основе различий в гидрофобности поверхности белков белки разделяются с помощью обратимого взаимодействия между белком и гидрофобной поверхностью HIC-сорбентов.

Режим работы: режим связывания-элюции или режим промывки
Режим связывания-элюции: выберите сорбент с подходящей гидрофобностью, добавьте в образец соль (высокой концентрации), сорбент HIC связывается с белком, элюируйте раствором с более низкой концентрацией соли, отделите целевой белок от примесей.

Режим промывки: выберите сорбент с высокой гидрофобностью, не добавляйте соль или добавьте соль (с низкой концентрацией) в образец; целевой белок проходит, в то время как примеси связываются с сорбентом HIC.

В приведенной ниже таблице представлены данные эксперимента по оптимизации процесса HIC для IgG4 bsAb (с введением ScFv в область Fc). Степень насыщения SEC составляет 85,6 %, содержание HCP — 36 ppm.

Таблица 1. Данные по очистке после оптимизации процесса HIC

Группа	Загрузка/мойка	Элюция	Восстановление (%)	SEC (%)	HCP (ppm)
Рис A（контрольная）	0.4 M Na₂SO₄ load /0.4 M Na₂SO₄，pH 8 wash	Decreasing Na₂SO₄ gradient，10CV	35.7	99.6	5
Рис B		Decreasing Na₂SO₄ gradient +increasing hexanediol gradient（5% hexanediol），10CV	78.4	99.4	2
Рис C		Decreasing Na₂SO₄ gradient+increasing arginine gradient（1M arginine），10CV	81.7	>99.8	3
Рис D	After affinity, Load at pH5（No Na₂SO₄）/0.4M Na2SO4 , pH 8 wash	Decreasing Na₂SO₄ gradient+ Increasing hexanediol gradient（5% hexanediol），10CV	74.9	98.4	<5

Рис. 1. Влияние градиента элюции гександиола и аргинина на кривую разделения на HIC-сорбенте

Согласно полученным результатам:
Гександиол и аргинин могут значительно повысить чистоту и выход целевых белков. Возможная причина может заключаться в следующем: гександиол и аргинин могут повысить полярность раствора и, следовательно, уменьшить взаимодействие HIC, стабилизировать конформацию белка и оптимизировать динамику элюции, что в конечном итоге улучшит селективность сорбента. Однако при практическом применении следует учитывать риск, связанный с добавками, и одновременно устранять его. Как показано в данном эксперименте, можно снизить сложность процесса путем упрощения условий загрузки образца

При выборе гидрофобных хроматографических сорбентов HIC необходимо учитывать такие факторы, как гидрофобность, плотность лигандов и свойства основной матрицы сорбентов. Выбирайте сорбент HIC с подходящей гидрофобностью в соответствии с рис. 2.

1. Степень гидрофобности лигандов HIC: бутил-S < бутил < октил < фенил

Рис. 2. Степень гидрофобности сорбентов HIC

2. Различия в разрешении в зависимости от размера частиц: сорбенты HP (34 мкм) > сорбенты Mustang (40 мкм) > сорбенты FF (90 мкм)
3. Выбор буфера: правильный тип и концентрация буфера являются важными параметрами, влияющими на связывающую способность и выбор HIC-сорбента.

Наиболее часто используемые растворы: (NH4)2SO4 (в пределах 2 М, pH не выше 8,0), Na2SO4 и NaCl.

См. влияние различных солей на HIC-сорбент:

Na₂SO₄ > (NH₄)₂SO₄ > NaCl > NH₄Cl > NaBr > NaSCN

4. Выбор ионной силы: разная ионная сила имеет разную селективность. Поскольку сила связывания определяется ионной силой, сила связывания и связывающая способность белка увеличиваются с повышением солености. Однако это может привести к осаждению белка из-за чрезмерной силы связывания, что затрудняет элюцию. В то же время слишком низкая соленость приведет к отрыву белка. Поэтому для первого эксперимента с неизвестным белком рекомендуются следующие условия буфера: связывающий буфер (50 мМ PBS pH 7,0, 1–1,5 М (NH₄)₂SO₄) + элюционный буфер (50 мМ PBS pH 7,0). Пожалуйста, корректируйте ионную силу на основе экспериментальных данных.
5. Выбор добавок: водорастворимые спирты, детергенты (повышают полярность раствора, уменьшают поверхность воды и ослабляют взаимодействия, что приводит к диссоциации белка. Например, гександиол, изопропанол), диссоциативные соли (уменьшают гидрофобные взаимодействия в растворе и приводят к диссоциации белка. Например, CaCl₂, MgCl₂).
6. Регулирование температуры: гидрофобное взаимодействие зависит от энтропии. С повышением температуры усиливается гидрофобное взаимодействие и сила Ван-дер-Ваальса, что приводит к более прочному связыванию с белками. Поэтому в ходе эксперимента необходимо контролировать температуру.

Заключение

Гидрофобные хроматографические сорбенты, являясь ключевым этапом в очистке биспецифических антител (bsAb), демонстрирует уникальные преимущества при удалении агрегатов. Путем выбора подходящего типа сорбента и оптимизации технологических параметров можно добиться эффективного отделения целевых молекул от примесей, что обеспечивает высокую степень очистки и выход целевых белков. Сорбенты HIC играют ключевую роль в масштабировании производства bsAb.

[1] Klein, Christian, et al. «Настоящее и будущее биспецифических антител для лечения рака». Nature reviews Drug discovery 23.4 (2025): 301-319.

[2] Li, Yifeng и др. «Дорожная карта очистки IgG-подобных биспецифических антител». Подходы к очистке, анализу и характеристике антител-основанных терапевтических средств (2020).

[3] Холл, Трои, Г. М. Келли и У. Р. Эмери. «Использование добавок в подвижной фазе для элюции биспецифических и моноклональных антител из фенольных сорбентов для хроматографии гидрофобного взаимодействия». Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 1096(2018):20–30.

[4] Чен, Серен В. и В. Чжан. «Современные тенденции и проблемы в последующей очистке биспецифических антител». Antibody Therapeutics 4.2 (2021).

[5] Эндрюс, А. Т. «Принципы очистки белков, методы высокого разрешения и их применение». Food Chemistry (1991).