Культивирование Aspergillus Oryzae в параллельном биореакторе T&J CloudReady

Для определения подходящих источников углерода для культивирования Aspergillus oryzae с высокой плотностью были протестированы четыре различных источника углерода или их комбинации с применением параллельных биореакторов и использованием веса биомассы в качестве индикатора. Результаты показали, что в течение логарифмической фазы кукурузный декстрин был более благоприятным для роста Aspergillus oryzae. Биореактор, в котором в качестве источников углерода использовалась комбинация глюкозы и кукурузной муки, достиг наибольшего веса биомассы в сыром виде, составившего 602,318 г/л.

Aspergillus oryzae (A. oryzae) принадлежит к подтипу Dikarya, классу Sordomycetes, отряду Sordariales и семейству Aspergillaceae. Это распространенный вид в роде Aspergillus. Этот аэробный нитчатый гриб быстро растет, его колонии сначала белые, а затем становятся желто-зелеными, зелеными или темно-зелеными (рисунок 1). Конидии сначала овальные или грушевидные, но при созревании обычно становятся сферическими или почти сферическими. Головки конидий обычно лучевидные, некоторые из них имеют форму рыхлой колонны [1]. A. oryzae признан общепризнанно безопасным (GRAS) Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). В Китае он в основном используется для ферментации пищевых продуктов, таких как соевый соус, мисо и различных алкогольных напитков. Он также используется в производстве пробиотиков, органических кислот, кормов для животных и ферментных препаратов. Среди промышленных штаммов A. oryzae имеет важное значение [2]. Хотя большинство A. oryzae культивируется с использованием твердофазной ферментации для производства соевого соуса, коджи и спиртных напитков, этот метод требует много времени, имеет менее контролируемые условия реакции и худшую воспроизводимость. В отличие от этого, жидкая ферментация требует меньше времени и позволяет в режиме реального времени контролировать условия реакции, что делает ее более подходящей для производства в промышленных масштабах [3]. Поэтому мы использовали параллельный биореактор CloudReady™ 1,5 L×4 от T&J Bio-engineering (Shanghai) Co., Ltd для оптимизации процесса культивирования A. oryzae с различными источниками углерода, что обеспечило поддержку данных для жидкой ферментации нитчатых грибов.

Рис.1

Рис. 2

2.1 Экспериментальный штамм: A. oryzae (As 3.863) был получен из Центра сохранения микробиологических штаммов провинции Гуандун. Концентрация спор в исходной жидкости составляла 2,35×10^7 спор/мл, количество инокулята — 5 %.

2.2 Экспериментальное оборудование: параллельный биореактор CloudReady™ 1,5 л×4, T&J Bio-engineering (Shanghai) Co., Ltd. В ходе предварительной разработки процесса на биореакторе Intelli-Ferm A мы наблюдали, что ферментационные сосуды с перегородками способствуют росту A. oryzae в виде гранул, в то время как сосуды без перегородок поддерживают его рост в виде мицелия. Поэтому мы удалили перегородки из ферментационного резервуара, чтобы оптимизировать процесс высокоплотного культивирования A. oryzae с различными источниками углерода.

2.3 Культуральные среды:

Культуральная среда для чашек: PDA (картофельно-декстрозный агар)

Культуральная среда для колбовых шейкеров: PDB (картофельно-декстрозный бульон)

Ферментационная среда: см. таблицу 1.

Период культивирования составил 112 часов. Через 66 часов все четыре реактора одновременно начали подавать 2 мл/ч 50% глюкозы, а через 89 часов скорость подачи была увеличена до 15 мл/ч 50% глюкозы. Как показано на рисунке 3, с течением времени ферментационный бульон в каждом реакторе постепенно становился более вязким. Влажный вес биомассы в каждом реакторе также быстро увеличивался с течением времени ферментации, как показано в таблице 3 и на рисунке 4.

Как показано в таблице 3, в реакторах R3 и R4, в которых в качестве источника углерода использовалась глюкоза, в период с 40 по 64 час наблюдалось увеличение влажного веса биомассы на 20,025 г/л и 97,208 г/л соответственно, после чего оно достигло минимальных значений. Однако после увеличения скорости подачи питания скорость роста постепенно вернулась к нормальным значениям. Это указывает на дефицит сахара в A. oryzae в тот момент, что сдерживало рост некоторых микроорганизмов.

Для реакторов R1 и R2, в которых в качестве источника углерода использовался кукурузный декстрин, максимальный вес биомассы в сыром виде увеличился за тот же период. Однако после добавления глюкозы скорость роста постепенно замедлилась. Это может быть связано с тем, что различные источники углерода в этот период вызывали различные метаболические пути в A. oryzae, что приводило к подавлению сахара. В целом, реактор R4, в котором в качестве источников углерода использовалась комбинация глюкозы и кукурузной муки, достиг наибольшего веса биомассы в сыром виде — 602,318 г/л при сборе урожая. Это указывает на то, что при текущей скорости подачи эта комбинированная смесь источников углерода более подходит для размножения A. oryzae. Однако не следует упускать из виду потенциал реакторов R1 и R2 с кукурузным декстрином в качестве источника углерода. Исключая влияние подачи глюкозы, кукурузный декстрин оказывает более выраженное влияние на размножение биомассы A. oryzae.

В этом эксперименте, основанном на параллельном биореакторе T&J CloudReady™ 1,5 л × 4, была продемонстрирована его способность выбирать различные источники углерода или композитные источники углерода, увеличивая влажный вес биомассы A. oryzae с 40,2 г/л до 602,318 г/л. CloudReady™, шестое поколение серии Minibox в линейке параллельных реакторов T&J, представляет собой реактор новой конструкции с интегрированным программным обеспечением (D2MS), аппаратным обеспечением и технологией распределенного управления. Он позволяет синхронизировать управление несколькими реакторами через единый интерфейс, что облегчает оптимизацию различных процессов управления. Этот реактор обладает высокой степенью настраиваемости автоматизации и возможностями дистанционного управления, что позволяет проектировать эксперименты, сравнивать и анализировать данные, а также управлять реактором на расстоянии. CloudReady™ также оснащен камерой наблюдения, которая снимает изображения в реальном времени для контроля уровня жидкости, состояния пены и вязкости ферментационного бульона, обеспечивая всесторонний обзор процесса ферментации.

Рис 6. T&J CloudReadyTM 1.5 L×4 parallel bioreactor

Ссылки

[1] Guangchao Meng. Скрининг штаммов, продуцирующих аминопептидазу, на основе технологии ARTP и оптимизация условий ферментации и энзимолиза [D]. Университет Чжэнчжоу, 2021. DOI: 10.27466/d.cnki.gzzdu.2021.002649

[2] Цзицун Лю. Исследование взаимосвязи между протеазой Aspergillus oryzae и уровнем экспрессии гетерологичного белка [D]. Университет науки и технологий Цзянси, 2022. DOI: 10.27751/d.cnki.gjxkj.2022.000136

[3] Хао Ван, Цзыин Лу, Инси Тан и др. Оптимизация условий жидкофазного брожения для производства нейтральной протеазы Aspergillus oryzae с помощью методологии поверхности отклика [J]. China Brewing, 2017, 36(12):40-45.