Как Cobetter повышает эффективность производства коллагена

Коллаген составляет примерно 25% от общего количества белка в организме человека, что делает его самым распространенным структурным белком. Он широко распространен в коже, костях, сухожилиях, кровеносных сосудах и других тканях, играя важную роль в поддержании структурной целостности и физиологической функции. На сегодняшний день идентифицировано 28 типов коллагена (тип I–XXVIII), среди которых тип I и тип III составляют примерно 95% от общего содержания коллагена.

Нативный коллаген состоит из трех α-цепей, каждая из которых состоит из примерно 1014 аминокислот, образуя характерную структуру тройной спирали с молекулярной массой около 300 кДа. Эта уникальная конформация лежит в основе его разнообразных биологических функций: повышение эластичности и увлажненности кожи, содействие заживлению ран, укрепление суставов и костей, улучшение качества волос и ногтей и даже поддержание здоровья зрения.

Как показано выше, продукты на основе коллагена можно условно разделить на три типа: коллаген, желатин и коллагеновые пептиды.

Мировой рынок коллагена продолжает стабильно расти. По данным Grand View Research, объем рынка достиг 17,258 млрд долларов США в 2022 году и, по прогнозам, к 2027 году вырастет до 22,622 млрд долларов США (среднегодовой темп роста 5,42%). Среди секторов применения основным фактором роста является здравоохранение (ожидается, что к 2027 году его объем достигнет 11,117 млрд долларов США, что составляет примерно 50%), за которым следуют косметика и продукты питания и напитки. Различные области применения соответствуют разным нормативным рамкам и стандартам качества, и с постоянным технологическим прогрессом границы применения коллагена продолжают расширяться.

В настоящее время производство коллагена в основном осуществляется двумя техническими способами: экстракция из животных и рекомбинантный подход.

Рекомбинантный коллаген подразделяется на три категории:
– Рекомбинантный человеческий коллаген (с полной тройной спиральной структурой)
– Рекомбинантный гуманизированный коллаген (содержащий частичные последовательности человеческого происхождения)
– Рекомбинантные коллагеноподобные белки (с более низкой гомологией последовательностей)

Обычные системы экспрессии включают Escherichia coli, дрожжи и клетки млекопитающих (такие как клетки CHO). Хотя детали процесса варьируются в зависимости от источника и платформы экспрессии, общий рабочий процесс производства обычно включает:

Ферментация/экстракция → Очистка → Очистка (удаление примесей, эндотоксинов, вирусов и т. д.) → Замена буфера/концентрация → Стерильная фильтрация, а также другие важные этапы обработки.

На этапе очистки после экстракции или ферментации, а также после осаждения или ферментативного расщепления в процессе очистки раствор часто имеет высокую мутность и содержит клетки, остатки, осадки и другие примеси. Для обеспечения бесперебойности последующих этапов обработки необходима надлежащая очистка и опыт.

Для удобства и эффективности осветления обычно предпочтительным выбором является глубинная фильтрация. Учитывая сложность раствора и различные технологические требования, Cobetter предлагает ряд решений для глубинной фильтрации с различной точностью и характеристиками, что позволяет гибко адаптироваться к этапам технологического процесса.

Культуральную жидкость CHO после ферментативного расщепления и корректировки pH оставляют на ночь для оседания. Начальная мутность полученного супернатанта >300 NTU.

Для определенных этапов процесса, где необходимо повторное использование расходных материалов или вызывает трудности высокое содержание твердых веществ, таких как дрожжевая ферментация, для осветления можно использовать половолоконные фильтры или кассеты микрофильтрации TFF.

Рекомбинантный гуманизированный коллаген, экспрессированный в дрожжевой системе. После центрифугирования корм имел мутность 147 NTU. Для тестирования выберите полые волокна с внутренним диаметром 1 мм и размером 0,2 мкм (HFEMIN0201030P).

Результаты: раствор был сконцентрирован примерно в 6 раз и прошел 6-кратную диафильтрацию с поддержанием высокого потока ~30 LMH. После фильтрации мутность снизилась до 3,41 NTU, что свидетельствует об отличном осветлении. В ретентате не было обнаружено целевого белка, что свидетельствует о незначительной адсорбции или удержании продукта.

Традиционные хроматографические сорбенты являются дорогостоящими и подвержены сокращению срока службы при работе с высоковязкими материалами. Кроме того, традиционные операции часто опираются на крупномасштабные хроматографические системы, что предъявляет более высокие требования к инвестициям в оборудование, площади помещений и планировке.

В результате отрасль постепенно переходит на технологию мембранной хроматографии. Благодаря более высокой загрузочной способности, более высокой скорости потока и более высокой устойчивости к загрязнению, мембранная хроматография позволяет значительно сократить расход расходных материалов, сократить время обработки и исключить такие трудоемкие этапы, как наполнение, разборка и хранение колонок. Она обеспечивает большую гибкость в эксплуатации и занимает меньше места.

В процессе очистки рекомбинантного коллагена I и III типа на этапе анионообменной хроматографии традиционные сорбенты сравнивались с мембранным хроматографическим фильтром Pultrix™ XQ компании Cobetter. Мембранный хроматографический фильтр достиг загрузочной способности 60 г/л, что в четыре раза превышает показатель традиционных сорбентов (15 г/л), при этом удалив более 95 % белков клеток-хозяев (HCP). С точки зрения выхода, коллаген I типа достиг 90 % при мембранной хроматографии по сравнению с только ~60 % при использовании традиционных сорбентов. Выход коллагена III типа также увеличился на 5 %, как показано ниже.

Исходя из требований процессов заказчика, Cobetter предлагает продукты для мембранной хроматографии с несколькими механизмами, включая анионообменную (AEX), катионообменную (CEX) и гидрофобную (HIC) хроматографию. Среди них мембранная хроматография AEX также широко применяется на таких важных этапах, как удаление эндотоксинов.

Обычная замена буфера и концентрация могут выполняться с помощью ультрафильтрационных кассет или полых волокон. Однако в случае высоковязких материалов, таких как коллаген животного происхождения, вязкость значительно увеличивается после концентрации, что создает серьезную проблему для стерильной фильтрации. Рекомендуется использовать стерильные половолоконные фильтры: сначала выполнить стерильную фильтрацию при более низкой концентрации, а затем перенести через асептическое соединение в стерильную полые волокнисту систему с половолоконными модулями для концентрации до целевого уровня. Такой подход эффективно повышает эффективность процесса и выход продукта.

Для продукта на основе коллагена животного происхождения с молекулярной массой выше 300 кДа и начальной концентрацией 1,0 мг/мл целью было его концентрирование до 5–10 мг/мл. Была протестирована кассета для ультрафильтрации Cobetter UFCLA0100001P (мембрана RC, стандартный грубый фильтр, 100 кДа). Процесс включал четырехкратный диализ для удаления примесей, а затем пятикратную концентрацию. Средний поток во время диализа составлял 137,44 LMH, а во время концентрации — 114,26 LMH.

Для натурального коллагенового продукта с целевой молекулярной массой 300 кДа была применена тангенциальная фильтрация для удаления низкомолекулярных примесей. Было проведено сравнение эффективности кассеты 100K TFF (стандартный грубый фильтр) и полых волокон (внутренний диаметр волокна 0,5 мм). Во время диализа и замены буфера были зарегистрированы показатели давления и расхода, как показано ниже.

Как показано в таблице, как кассета, так и половолокнные модули продемонстрировали высокую скорость потока во время замены буфера и удаления примесей. После очистки восстановление потока воды превысило 95%, что соответствует требованиям заказчика по завершению процесса в короткие сроки. Оба фильтра могут быть повторно использованы, что позволяет эффективно снизить производственные затраты.

Выбор и загрузочная способность фильтров для удаления вирусов тесно связаны с молекулярной массой целевого белка:

• Для рекомбинантного коллагена с молекулярной массой менее 200 кДа обычно рекомендуются вирусные фильтры с PES-мембраной (такие как ViruClear™ VF или ViruClear™ VF Plus).
• Для коллагена с молекулярной массой выше 200 кДа или полноразмерных последовательностей более высокая молекулярная масса и повышенная вязкость могут привести к быстрому загрязнению и ограниченной загрузке при использовании PES-мембран. В таких случаях рекомендуется использовать RC-мембранные вирусные фильтры (такие как ViruClear™ RCH), которые обеспечивают более высокую загрузочную способность и меньшее снижение потока.

В настоящее время RCH успешно используется клиентами в процессах очистки от вирусов в производственных масштабах 6000 л.

В другом случае у клиента в исходном процессе использовалось решение для фильтрации вирусов другой марки, которое обеспечивало извлечение только 30 %. Благодаря оптимизации этапов предварительной фильтрации и фильтрации вирусов с помощью фильтров Cobetter общее извлечение было улучшено примерно до 90 %.

В системе экспрессии на основе дрожжей для рекомбинантного гуманизированного коллагена было оценено влияние концентрации белка на эффективность стерильной фильтрации. Для фильтрации растворов с концентрацией 15 г/л (левое изображение) и 40 г/л (правое изображение) использовался PVDF-фильтр Cobetter (LHPVND0022). Результаты представлены ниже.

В данном случае нагрузочная способность стерильной фильтрации концентрированного раствора была относительно низкой (примерно 45 л/м²). Напротив, для неконцентрированных растворов или растворов с более низкой концентрацией нагрузочная способность увеличилась почти в 3 раза (примерно 130 л/м²).

Поэтому, как обсуждалось ранее, при проектировании процесса целесообразно рассмотреть возможность проведения стерильной фильтрации до концентрирования, а затем асептической концентрирования с использованием стерильного фильтра с полыми волокнами для достижения целевой концентрации. Окончательная конфигурация процесса должна быть всесторонне оценена с учетом затрат, рисков и эксплуатационной гибкости. Кроме того, можно также рассмотреть возможность применения комбинированной стратегии фильтрации. Соответствующая предварительная фильтрация может значительно улучшить загрузочную способность фильтра стерилизационного класса.

В этой статье представлены комплексные решения Cobetter по обработке коллагена, охватывающие все этапы производства от получения до очистки. Объединяя типичные примеры из практики с анализом ключевых технических проблем, мы стремимся предоставить практические рекомендации по оптимизации процессов и содействовать развитию технологий производства коллагена.

Следует отметить, что из-за разнообразия источников коллагена, значительных различий в молекулярной массе и различных технологических маршрутов в реальных условиях часто возникают серьезные технические проблемы.