Центрифужные фильтры на основе ультрафильтрации остаются одним из наиболее широко используемых инструментов в современных лабораториях биохимии и молекулярной биологии. Будь то концентрация нуклеиновых кислот или белков, буферный обмен или обессоливание образцов, эти фильтры — быстрое, надежное и щадящее решение.
Однако добиться высокой степени извлечения белка не всегда просто. Конечный выход может зависеть от многих факторов, таких как выбор материала для ультрафильтрации, свойства образца, скорость центрифугирования и т. д. Сегодня мы поделимся семью советами, которые помогут вам более эффективно использовать ультрафильтрационные центробежные фильтры и повысить степень извлечения, эффективность и сохранность образцов.
1. Выберите правильный MWCO (ограничение по молекулярной массе)
Вероятно, наиболее важным шагом для максимального извлечения белка является выбор подходящего MWCO. При несоответствии MWCO может произойти значительная потеря образцов или неэффективная концентрация.
Почему важен MWCO
Слишком высокий MWCO – целевой белок может проходить через мембрану. Слишком низкий MWCO – замедляется фильтрация и повышается вероятность загрязнения мембраны.
Общие рекомендации
Выберите MWCO с молекулярной массой в 2–3 раза меньше молекулярной массы целевого белка. MWCO с молекулярной массой 50 кДа обычно используется для крупных антител (например, IgG с молекулярной массой 150 кДа). MWCO с молекулярной массой 3–10 кДа обычно идеально подходит для белков с меньшей молекулярной массой (10–30 кДа).
Дополнительный совет
Если ваш белок более или менее гибкий или вытянутый, уменьшите размер MWCO на один уровень, чтобы избежать непреднамеренных потерь при прохождении через мембрану. Подробнее об этом читайте в статье «Как выбрать фильтры MWCO».
2. Предварительно промойте или увлажните мембрану, чтобы уменьшить связывание с белками.
Даже мембраны с низким уровнем связывания белков могут адсорбировать белки при первом использовании, особенно если мембрана сухая или если белок подвергался воздействию консервантов.
Как помогает предварительное увлажнение
Удаляет глицерин и консерванты. Увлажняет мембрану, выравнивая микроскопические поры. Уменьшает неспецифические взаимодействия.
Как это сделать (на примере центрифужного фильтра объемом 15 мл)
Добавьте в фильтр 12–15 мл чистой воды, деионизированной воды или буфера. Отцентрифугируйте на низкой скорости (4000 x g для роторного центрифужного ведра или 5000 x g для ведра с фиксированным углом наклона) в течение 5–10 минут. Слейте всю жидкость из устройства для ультрафильтрации и пробирок центрифуги. Если помехи не исчезают, промойте мембрану 0,1 н. раствором NaOH при указанных выше условиях, затем 2–3 раза промойте ультрачистой, деионизированной водой или буферным раствором. После смачивания ультрафильтрационной мембраны поддерживайте ее во влажном состоянии до тех пор, пока она не будет использована. Это простое действие позволяет повысить эффективность извлечения на 5–15 %, особенно при работе с небольшими образцами или низкими концентрациями.
3. Оптимизируйте скорость и время центрифугирования
Скорость центрифугирования напрямую влияет на производительность и стабильность белка. Слишком высокая скорость центрифугирования может привести к повышенному напряжению мембраны, что может ускорить ее загрязнение, незначительной деформации мембраны, прохождению гибких или частично развернутых белков через фильтр. Напротив, низкая скорость центрифугирования может увеличить время обработки и способствовать агрегации белков.
Рекомендации
По возможности, придерживайтесь рекомендованного производителем диапазона скоростей. В случае с деликатными белками следует использовать самую низкую эффективную скорость. Остановите центрифугу до высыхания ретентата; сухие мембраны могут захватывать белки и значительно снижать извлечение.
При возникновении сомнений
Установите начальную скорость на уровне 50-60% от максимальной, оцените результат и повторите.
4. Уменьшите неспецифическое связывание с помощью подходящих буферных растворов
Потеря белка часто происходит из-за его адсорбции на поверхности, а не из-за прохождения через мембрану. Оптимизация состава буфера и уровня pH может помочь свести к минимуму неспецифическое связывание.
Добавки в буфер, которые помогают
0,01–0,1 % Tween-20 снижает гидрофобное связывание (необходимо проверить совместимость с последующими анализами). Низкое содержание соли (50–150 мМ NaCl) помогает свести к минимуму электростатическое связывание. Предварительная блокировка бычьим сывороточным альбумином (по желанию). В случае с очень липкими белками перед добавлением образца проведите промывку разбавленным бычьим сывороточным альбумином (необходимо проверить совместимость с последующими анализами).
Рекомендации по поддержанию pH
Белки имеют тенденцию к коагуляции или слипанию вблизи изоэлектрической точки (pI). Чтобы свести это к минимуму, отрегулируйте pH на 0,5–1 единицу выше или ниже pI. Используйте хорошо зарекомендовавшие себя стабилизирующие буферы (например, HEPES, трис или фосфатный буфер) для стабилизации белков.
5. Сведите к минимуму потерю объема образца, используя правильные методы загрузки
Неправильная загрузка может привести к пенообразованию, турбулентности или неравномерному потоку, что способствует адсорбции белков или загрязнению мембраны.
Советы по оптимальной загрузке
Медленно и аккуратно дозируйте, прижимая наконечник дозатора к стенке концентратора. Любой ценой избегайте образования пузырьков. Если это возможно в вашем случае, нанесите на стенки предварительное покрытие (например, разбавленный бычий сывороточный альбумин или 0,01–0,05 % Tween-20), чтобы уменьшить адсорбцию.
Не перегружайте устройство, но старайтесь загружать его почти до рекомендованного максимального объема, чтобы минимизировать потери.
Почему это важно
Чаще всего белок теряется в мембране и на стенках устройства, которые являются первыми точками контакта. Постепенная нагрузка помогает предотвратить денатурацию и агрегацию белков, а также свести к минимуму силы сдвига.
6. Используйте импульсное или прерывистое центрифугирование для защиты хрупких белков.
Чтобы повысить эффективность выделения хрупких белков, можно использовать прерывистое центрифугирование вместо непрерывного вращения на протяжении всего процесса.
Как это работает
Пауза между циклами снижает напряжение сдвига. Белки получают возможность перераспределиться, а не концентрироваться на поверхности мембраны. Это предотвращает локальный перегрев при длительном центрифугировании.
Типичный импульсный цикл
Центрифугируйте в течение 5–7 минут. Дайте отстояться в течение 2 минут. Повторяйте до достижения необходимой концентрации.
Для кого подходит этот метод
– Ферментов
– Антител
– Мультисубъединичных белковых комплексов
– Мембранных белков
– Белков, склонных к денатурации или агрегации.
Импульсное центрифугирование может повысить выход высокочувствительных образцов на 10–20 %.
7. Соберите максимальное количество образца, используя правильные методы сбора ретентата.
После концентрирования белка необходимо тщательно собрать образец, чтобы не потерять драгоценный материал.
Советы по сбору.
Используйте наконечники для дозаторов с низким уровнем удерживания. Промойте устройство небольшим количеством буфера и смешайте промывочную жидкость с ретентатом. Аккуратно переверните устройство, чтобы собрать все капли. Для более крупных центрифужных фильтров можно использовать медленное вращение на низкой скорости, чтобы перемешать остатки жидкости на дне.
Избегайте чрезмерного концентрирования. При чрезмерном центрифугировании белки могут: выпасть в осадок, агрегировать, образовать нерастворимый осадок.
Прекратите центрифугирование, как только будет достигнут нужный объем, чтобы сохранить целостность белков.
Почему так важен правильный выбор ультрафильтрационного центробежного фильтра
Независимо от того, насколько хороша ваша техника, она не может заменить ультрафильтрационный фильтр неудачной конструкции.
Высококачественные ультрафильтрационные центробежные фильтры обладают следующими особенностями:
– Высокая степень извлечения и 80-кратная концентрация
– Мембрана из регенерированной целлюлозы обеспечивает сверхнизкое связывание с белками и широкую химическую совместимость
– Быстрое время обработки, простота в использовании
– Герметичная конструкция
Эти конструктивные особенности напрямую влияют на извлечение пробы и эффективность обработки. При выборе центрифужных фильтров для вашей лаборатории следует учитывать следующие факторы:
– Максимальный объем образца (например, 0,5 мл, 2 мл, 4 мл, 15 мл)
– Химическая совместимость
– Молекулярная масса и концентрация образца
– Допустимая скорость вращения и механическая прочность
– Ожидаемая эффективность восстановления
Заключительные мысли
Чтобы добиться максимального выхода белка при использовании ультрафильтрационных центрифужных фильтров, недостаточно просто следовать инструкциям на упаковке. Семь приведенных выше советов — выбор подходящего MWCO, оптимизация центрифугирования, предварительное смачивание мембраны, подбор подходящих буферных условий, бережная загрузка, импульсное центрифугирование и эффективный сбор — помогут вам получить высококачественные результаты.
В сочетании с высокопроизводительным фильтром эти методы обеспечат: более высокий выход белка; большую воспроизводимость результатов. Сокращение времени обработки Больше достоверных экспериментальных данных. Независимо от того, с каким типом образца вы работаете — антителами, ферментами или мультисубъединичными комплексами, — эти методы помогут защитить образец и получить воспроизводимые и качественные результаты.
Ультрафильтрационные центрифужные фильтры Cobetter обеспечивают высокую степень извлечения и стабильную, надежную работу. Ознакомьтесь с полным ассортиментом наших фильтров и выберите подходящий.