Downstream стратегия очистки конъюгатов антитело-препарат

Конъюгаты антител и лекарственных препаратов (ADC) часто называют «биологическими ракетами» в лечении рака. Используя высокую специфичность моноклональных антител для нацеливания на опухолевые клетки, ADC обеспечивают точную доставку цитотоксических веществ, значительно повышая терапевтическую эффективность и снижая системную токсичность. С момента одобрения первого препарата ADC, Mylotarg, в 2000 году, по состоянию на 2024 год во всем мире было одобрено более 17 препаратов ADC, предназначенных для лечения как гематологических злокачественных новообразований, так и солидных опухолей, с общей рыночной стоимостью более 10 миллиардов долларов США. Однако структурная сложность ADC предъявляет строгие требования к производственным процессам. В этой статье представлен углубленный анализ стратегий downstream очистки ADC, связанных с этим технических проблем и соответствующих решений.

Основная цель разработки биопроцесса заключается в создании надежного и хорошо контролируемого производственного процесса, который обеспечивает воспроизводимый выпуск препаратов, отвечающих заранее определенным качественным характеристикам.

Для традиционных биологических препаратов, не относящихся к ADC, критические показатели качества (КПК) включают ключевые параметры, которые могут повлиять на клиническую безопасность и эффективность. Например вариации, связанные с размером продукта (например, агрегаты и фрагменты), неоднородность заряда и окисление, а также примеси, связанные с процессом (белки клеток-хозяев и остаточная ДНК), концентрация продукта и биологическая активность.

Ввиду двойственной природы ADC как биологических макромолекул и низкомолекулярных лекарственных средств, необходимо тщательно учитывать дополнительные показатели качества, включая соотношение лекарственного средства к антителу (DAR), распределение видов DAR, остаточную свободную полезную нагрузку и остаточные растворители от реакции конъюгации.

• Значение DAR и распределение видов DAR: эти параметры напрямую влияют на эффективность и безопасность лекарственных средств ADC. Производственные процессы должны обеспечивать стабильность значения DAR и его распределения от партии к партии.

• Свободные активные вещества: как высокорисковые примеси, связанные с процессом, неконъюгированная низкомолекулярная полезная нагрузка не имеет механизма целевой доставки и поэтому не может избирательно воздействовать на опухолевые клетки. Вместо того, чтобы способствовать терапевтической эффективности, она может представлять риск системной токсичности.

• Остаточные растворители от реакции конъюгации: при разработке процесса необходимо также уделять внимание эффективности удаления примесей, связанных с процессом, которые попадают в продукт во время реакции конъюгации, включая органические растворители (например, DMF, DMSO) и восстановители (например, TCEP), чтобы конечный продукт соответствовал заранее определенным критериям качества.

◉ Удаление свободного активного вещества с помощью ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF)

После реакции конъюгации обычно присутствуют свободные активные вещества и остаточные растворители, которые необходимо удалить. Ультрафильтрация/диафильтрация (UF/DF) — широко используемый метод замены буфера в биофармацевтической промышленности. Выбирая мембраны UF/DF с подходящим молекулярным весом, можно эффективно удалить низкомолекулярные примеси, включая остаточные растворители и свободную полезную нагрузку, сохранив при этом продукт. Как показано на рис. 1, в идеальных условиях UF/DF может снизить количество примесей после конъюгации до приемлемого уровня.

Рис. 1. Очистка от примесей во время UF/DF в зависимости от объема диафильтрации.

(A) Остаточные растворители (B) Свободное активное вещество

В случае некоторых ADC свободные примеси и примеси, связанные с полезной нагрузкой, могут не удаляться эффективно с помощью UF/DF. Как показано на рис. 2. При UF/DF, выполненной с использованием мембраны 30 кДа, было оценено поведение двух свободных примесей, связанных с лекарственным средством, обе с молекулярной массой менее 2 кДа. Примесь A прошла через мембрану UF/DF и была удалена более чем на 2 log во время этого этапа, тогда как примесь B не была значительно очищена даже после 10 диафильтрационных объемов. Такое поведение может быть частично объяснено самоассоциацией полезной нагрузки, которая увеличивает ее кажущийся размер в водной среде, или неспецифическими взаимодействиями между свободной полезной нагрузкой и ADC.

• Если UF/DF не удается снизить количество свободного активного вещества и связанных с ним примесей до приемлемого уровня, требуются этапы хроматографической очистки.
• Если в результате реакции конъюгации образуется недопустимое количество вариантов продукта или агрегатов, необходима хроматографическая очистка ADC.

Рис. 2. Очистка от примесей во время UF/DF в зависимости от объема диафильтрации.

(A) Остаточные растворители (B) Свободные активные вещества

◉ Удаление свободного активного вещества с помощью катионообменной хроматографии
Хроматография с связыванием и элюцией, как традиционный метод разделения, может эффективно применяться для удаления свободного активного вещества из ADC. Этот подход использует выраженные различия в физико-химических свойствах ADC и молекул свободного активного вещества, что позволяет осуществлять эффективное разделение посредством селективной адсорбции.

В катионообменной хроматографии ADC, неконъюгированные антитела которых обычно имеют относительно высокие изоэлектрические точки, несут положительный заряд в условиях низкой проводимости и кислотной нагрузки и поэтому сильно удерживаются на сорбенте. Напротив, большинство молекул свободной полезной нагрузки (свободного активного вещества) имеют небольшой размер и являются нейтральными или отрицательно заряженными, что препятствует их связыванию с сорбентом и позволяет удалять их непосредственно в проточном потоке. Как показано на рис. 3, содержание свободной полезной нагрузки может быть значительно уменьшено с 52,2 % до 5,0 % путем сбора в проточном потоке во время загрузки образца и последующей промывки с помощью уравновешивающего буфера.

Рис. 3. Профиль очистки с помощью катионообменной хроматографии

Проблема: Высокогидрофобные остаточные активные вещества могут проявлять неспецифическую адсорбцию на сорбенте или ADC, что приводит к неполному очищению.

Решение:
– скрининг катионообменных сорбентов с различными лигандами;
– добавление низких концентраций органических растворителей или поверхностно-активных веществ в промывочный буфер.

Из-за сложности процессов производства ADC после этапа конъюгации уровень агрегатов может повыситься до недопустимых значений. В результате может потребоваться введение этапа очистки после конъюгации, чтобы обеспечить соответствие процесса требуемым характеристикам качества продукта. В этом контексте для эффективного удаления агрегатов из ADC можно применять катионообменную хроматографию с связыванием и элюцией. Как показано на рис. 4, этот подход позволяет осуществлять эффективное разделение на основе физико-химических различий между агрегатами и мономерами.

Рис. 4. Удаление агрегатов с помощью катионообменной хроматографии

Контроль DAR с помощью гидрофобной взаимодействующей хроматографии

Поскольку ADC с разными значениями DAR демонстрируют разную гидрофобность, для контроля профиля DAR можно использовать гидрофобную хроматографию (HIC). Как показано на рис. 5, виды с DAR 0 имеют низкую гидрофобность и, как правило, не задерживаются на сорбенте HIC, проходя через него во время загрузки образца. Напротив, АДК с DAR 1 и DAR 2 улавливаются HIC и последовательно элюируются во время градиентной элюции.

Рис. 5. Разделение ADC с различными значениями DAR с помощью гидрофобной хроматографии

В связи с двойственной природой конъюгатов антитело-препарат (ADC), которые являются одновременно биологическими макромолекулами и низкомолекулярными соединениями, их очистка требует не только удаления обычных примесей, но и удаления свободный активных веществ, остаточных растворителей из реакции конъюгации, а также контроля значения DAR и распределения видов DAR.

Для достижения этих целей требуются несколько стратегий очистки:

• UF/DF обеспечивает быструю замену буфера и удаляет большую часть низкомолекулярных примесей.

• Катионообменная хроматография, такая как Diamond CD-S, которая обеспечивает высокую связывающую способность и хорошую толерантность к органическим растворителям, использует различия в заряде для эффективного удаления свободной полезной нагрузки, а также эффективного удаления агрегатов.

• Гидрофобная хроматография (HIC) использует различия в гидрофобности между молекулами ADC с разными значениями DAR для тонкого разделения, что позволяет точно контролировать значение DAR и распределение видов DAR.

[1] Dumontet, Charles , J. M. Reichert , and L. A. Beck . «Антитело-лекарственные конъюгаты достигли зрелости в онкологии». Nature reviews Drug discovery 22.8(2023):641-661.

[2] Хатчинсон, Мэтт Х. и др. «Разработка процесса и производство конъюгатов антител с лекарственными препаратами». Биофармацевтическая переработка. Elsevier, 2018. 813-836.

[3] Хендрикс, Рэйчел и др. «Упрощенная стратегия разработки процессов очистки конъюгатов антител с лекарственными препаратами с использованием катионообменной хроматографии в проточном режиме». Журнал хроматографии, A: включая электрофорез и другие методы разделения 1666-(2022):1666.

[4] Лю, Хуйфан и др. Метод очистки конъюгатов антител с лекарственными препаратами с помощью катионообменной хроматографии. CN104208719A, 2014.

[5] Мацуда Ю., Леунг М., Окудзуми Т., Мендельсон Б. Стратегия очистки с использованием гидрофобной хроматографии для получения гомогенных видов из сайт-специфического антитело-лекарственного конъюгата, произведенного AJICAP™ первого поколения. Антитела (Базель). 18 мая 2020 г.; 9(2):16. doi: 10.3390/antib9020016. PMID: 32443479; PMCID: PMC7344391.