Экзосомы, часть II: осветление и разбор процесса ультрафильтрации

Различные стратегии обработки экзосом обобщены в таблице 5 ниже:

Тип образца	Упрощенный план подготовки	Рекомендуемый метод фильтрации
Надосадочная жидкость адгезивных клеток	Центрифугируйте при 3000 × g в течение 10 минут, чтобы удалить крупные частицы.	Одноступенчатая фильтрация: Cobetter CHT15 (1,5 мкм) или 1070PEP (0,8~18 мкм)
Бросс для ферментации суспензионных клеток	Пропустить центрифугирование, фильтровать напрямую	Двухступенчатая фильтрация: 4070SP (4~18 мкм) + 1070PE (0,8~18 мкм)
Экзосомы растительного происхождения	Центрифугируйте или используйте предварительный фильтр (500 меш)	Двухступенчатая фильтрация: Cobetter 4070SP + 1070PE
Экзосомы, полученные из молока	Кислотные осадки, без центрифугирования фильтруйте подкисленный супернатант напрямую	Cobetter CHT15 (1,5 мкм) или CHT50 (5,0 мкм)

Настройка устройства:

Соберите систему фильтрации в соответствии с требованиями Pmax (насос → датчик давления → фильтр → резервуар). Предпочтительно использовать кассеты с глубинными фильтрами (например, Cobetter 1070PE) или капсульные фильтры из полипропилена.

Соответствие потока: поддерживайте поток на уровне 150–200 LMH для адгезивных клеток; 100–150 LMH для суспензионных клеток, растений или образцов, полученных из молока.

Измерение объема удержания: предварительно заполните трубки деионизированной водой, установите начальный поток на 150 LMH, продуйте воздухом и измерьте объем удержания (15–45 мл) для последующей калибровки выхода.

Этапы работы Pmax обобщены в таблице 6 ниже:

Таблица 6. Этапы осветляющей фильтрации

Этап	Ключевые операции	Мониторинг параметров
1. Предварительная промывка	Промыть водой (15–230 мл в зависимости от однослойной или двухслойной мембраны)	Обеспечьте стабильное давление <5 psi
2. Уравновешивание буфера	Промыть PBS или физиологическим раствором, 2–3× рабочий объем	Мутность <1 NTU
3. Загрузка образца	Непосредственная обработка супернатанта клеточной культуры или ферментационного бульона	Запишите начальную мутность; поддерживайте температуру в пределах ±2 °C.
4. Динамическая фильтрация	Работайте в режиме постоянного потока, контролируйте давление и мутность в режиме реального времени	Предельное давление: 14,5 фунтов на квадратный дюйм; мутность <20 NTU

Кривая сопротивления-нагрузки: нанесите на график нагрузку фильтрации (л/м²) на оси X и сопротивление фильтрации (фунт/кв. дюйм) на оси Y, чтобы получить тренд данных (см. рисунок 1).

Коэффициент безопасности и площадь установки:

Рекомендуемая площадь: Arecommend= Amin × 1,5.
Фактическая площадь установки (Ainstall) должна быть ≥ Arecommend, а коэффициент безопасности можно рассчитать как SF = Ainstall / Amin.

Экзосомы — это гибкие и деформируемые наноразмерные везикулы. Под воздействием внешних сил, таких как трансмембранное давление (ТМП) или напряжение сдвига, они могут временно менять форму — сплющиваться или растягиваться под давлением. На эту деформацию могут влиять такие факторы, как уровень давления и свойства буфера (включая вязкость, ионную силу и осмотическое давление). В результате экзосомы могут уменьшаться в размере и проходить через мембранные поры, диаметр которых меньше их номинального диаметра. Таким образом, при выборе размера пор полых волокон и оптимизации параметров процесса необходима экспериментальная проверка. На основе данных о применении рекомендуемые конфигурации полых волокон для ультрафильтрации экзосом приведены в таблице ниже: Таблица 7. Выбор ультрафильтрации

Образец	Размер частиц	Рекомендуемое MWCO
NSC	30–60 нм, в основном около 40 нм	50 / 100 кДа
iPSC	50–110 нм, в основном около 75 нм	100 / 300 кДа
MSC	134.4 ± 3.9 нм	300 / 500 кДа

Цель: определить диапазон сил сдвига, при котором сохраняется высокая скорость потока и стабильность экзосом.

Регулировка силы сдвига: установите скорости тангенциального потока, соответствующие скоростям сдвига 2000 с⁻¹, 3000 с⁻¹ и 4000 с⁻¹, поддерживая постоянное трансмембранное давление (ТМП) (первоначально рекомендуется 3–7 фунтов на кв. дюйм).

Параметры мониторинга: средний поток (LMH): регистрируйте расход пермеата на единицу площади мембраны.
Время обработки: измерьте время, необходимое для достижения того же коэффициента концентрации.

Стабильность экзосом: распределение частиц по размерам: используйте NTA или DLS для сравнения среднего размера частиц и индекса полидисперсности (PDI) до и после обработки.

Целостность маркеров: обнаружьте маркерные белки, такие как CD63 и TSG101, с помощью вестерн-блоттинга.
Морфология: изучите структуру экзосом с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), чтобы проверить, нет ли разрывов или агрегации.

Заключение: выберите силу сдвига, которая обеспечит высокий поток, короткое время обработки и стабильные характеристики экзосом (PDI < 0,2 и восстановление маркеров > 90 %).

Цель: определить диапазон TMP, при котором поток максимален, а утечка экзосом через мембрану предотвращена.

План эксперимента: Настройки градиента TMP. В зависимости от разницы в вязкости исходного материала (например, экзосом, полученных из молока, с высокой вязкостью, и экзосом, полученных из МСК, с низкой вязкостью) установите следующие градиенты TMP:

① Подача сырья с низкой вязкостью: 3 фунта на кв. дюйм, 5 фунтов на кв. дюйм, 7 фунтов на кв. дюйм.
② Подача сырья с высокой вязкостью: 10 фунтов на кв. дюйм, 15 фунтов на кв. дюйм, 20 фунтов на кв. дюйм.

Контролируемые параметры: Кривая зависимости расхода от температуры: постройте график зависимости расхода от температуры, чтобы определить точку перегиба, в которой расход становится независимым от давления.

Утечка экзосом:
① Измерьте содержание экзосом в пермеате (с помощью количественного определения маркеров методом NTA или ИФА).
② Порог утечки: <5 % (исходя из исходного общего количества частиц).

Оценка поляризации концентрации: Проанализируйте корреляцию между скоростью снижения потока и TMP.

Вывод:
Выберите значение TMP непосредственно перед точкой, где поток все еще зависит от давления и убедитесь в отсутствии значительной утечки экзосом.

Цель: сбалансировать поток, время обработки, эффективность удаления примесей и активность экзосом.

План эксперимента: оптимизация коэффициента концентрации. Установите целевые коэффициенты концентрации на уровне 5×, 10× и 15× (учитывайте потенциальное влияние осмотического давления при диафильтрации с высокой концентрацией).

Контролируемые параметры:
① Степень извлечения экзосом (с помощью нитрозомочевины или иммуноферментного анализа).
② Остаточные примеси (общая концентрация белка с помощью бицинхонинового анализа).
③ Риск агрегации (изменение индекса полидисперсности).

Оптимизация коэффициента диафильтрации: используйте режим диафильтрации с равным объемом (DF) с коэффициентами диализа 3×, 5× и 7× (кратность объема буфера).

Параметры мониторинга:
– Эффективность удаления примесей (содержание ГПУ, изменение рН или электропроводности).
– Восстановление и активность экзосом (уровни экспрессии маркеров).

Вывод: выберите комбинацию параметров концентрации и диафильтрации, которая обеспечивает восстановление экзосом на уровне >90% и удаление примесей на уровне >95%.

Процесс ультрафильтрации и замены буфера: Установка модуля → Промывка водой (очищенной водой) → Обеззараживание 0,5 моль/л NaOH → Промывка водой (очищенной водой) → Проверка потока воды → Проверка целостности → Стабилизация буфера → Оптимизация TMP → Концентрирование и диафильтрация (контроль проводимости/pH во время диафильтрации) → Извлечение продукта (верхний слив) → Промывка буфером → Промывка водой → Обеззараживание 0,5 моль/л NaOH → Промывка водой → Проверка потока воды → Проверка целостности → Хранение в 0,1 моль/л NaOH.

(1) Сборка системы и предварительная обработка: Установите картридж с полыми волокнами (выбранный в соответствии с MWCO) и подключите насос, датчики давления и резервуары для подачи/ретентата. Промойте систему сверхчистой водой до полного удаления воздуха. Проведите щелочную дезинфекцию 0,5 моль/л NaOH, затем тщательно промойте водой. Перед использованием измерьте расход воды и проведите проверку целостности. Перед загрузкой образца выдержите мембрану в буфере в течение 3–5 минут.

(2) Инициализация параметров: установите начальную скорость сдвига (например, 3000 с⁻¹) и давление (например, 0,8 бар). Запустите рециркуляцию тангенциального потока и дайте системе стабилизироваться в течение 3–5 минут.

(3) Фаза концентрирования: отрегулируйте клапан на стороне ретентата для контроля TMP. Постоянно контролируйте поток пермеата, давление и объем подачи. Записывайте время процесса и рабочие параметры на протяжении всего цикла.

(4) Фаза диафильтрации: переключитесь в режим диафильтрации с равным объемом. Добавляйте буфер для диафильтрации с постоянной скоростью, поддерживая давление в системе. Контролируйте проводимость до тех пор, пока она не стабилизируется, что будет свидетельствовать о завершении процесса обмена примесями.

(5) Сбор и очистка продукта: соберите ретентат (продукт из экзосом) и проанализируйте степень извлечения и наличие остаточных примесей. Очистите фильтрующий картридж из полого волокна с помощью 0,5 моль/л раствора NaOH, затем тщательно промойте его сверхчистой водой. Повторно проверьте расход воды после использования, чтобы оценить эффективность очистки, и проведите еще один тест на целостность, чтобы убедиться, что полые волокна не повреждены. Для хранения поместите использованный фильтрующий половолоконный картридж в раствор NaOH с концентрацией 0,1 моль/л в качестве консервирующей среды.

Размер и концентрация частиц:
Метод: анализ отслеживания наночастиц (NTA) или динамическое рассеяние света (DLS).
Характеристики: распределение частиц по размерам в диапазоне от 30 до 150 нм с показателем PDI < 0,2.
Морфология: оценка с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для подтверждения целостности везикул.

Идентификация маркеров:
Положительные маркеры: CD9, CD63 и CD81 (определяются с помощью иммуноферментного анализа или вестерн-блоттинга).
Отрицательные маркеры: кальнексин и цитохром С (используются для исключения загрязнения клеточным мусором).

Содержание нуклеиновых кислот:
РНК: количественный анализ микроРНК или общей РНК с помощью количественной ПЦР (RIN > 7).
ДНК: остаточное содержание геномной ДНК должно составлять < 5 %.

Эндотоксины: определяется с помощью анализа лизата амебоцитов Limulus (LAL); содержание в образцах фармацевтического качества должно быть < 0,25 EU/мл.
Стерильность: проверяется методом мембранной фильтрации в соответствии с фармакопейными микробиологическими нормами.
Остаток белка клетки-хозяина (HCP): количественно определяется с помощью анализа BCA или ELISA, пороговые значения определяются в зависимости от происхождения образца.

Биологическая активность:
Анализ поглощения клетками (экзосомы, меченные флуоресцентными метками, анализируются с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии).
Функциональные анализы in vitro (например, оценка стимулирующего миграцию или противовоспалительного действия экзосом, полученных из стволовых клеток). Эффективность загрузки лекарственного средства (если применимо): определяется с помощью ВЭЖХ или УВЭЖХ по скорости инкапсуляции и грузоподъемности.

Экзосомы — это новый тип биологического носителя, процесс их производства и контроля качества всё ещё совершенствуется. Выделение, очистка и контроль качества являются ключевыми этапами как для исследований, так и для коммерческого производства. Благодаря постоянному технологическому прогрессу индустриализация экзосом будет стремительно развиваться. В фармацевтической отрасли стандартизированные системы производства и контроля качества помогут обеспечить их клиническую безопасность и эффективность.