Как основной материал для мРНК-вакцин и вирусных векторов, плазмидная ДНК (pDNA) находится на переднем крае борьбы с раком, сердечно-сосудистыми заболеваниями, нарушениями иммунной системы и инфекционными заболеваниями. Производство pDNA наглядно показывает узкое место подобных процессов — традиционные системы не только имеют низкую производительность, но и требуют сложных процессов очистки, что ограничивает масштабируемость и устойчивость всего производственного процесса.
Классификация плазмид
Суперскрученная плазмидная ДНК (sc pDNA)
Также известная как ковалентно замкнутая кольцевая ДНК (cccDNA), эта форма создается, когда двухцепочечная ДНК скручивается сама на себя, как спиралевидная веревка, образуя (отрицательные) суперспирали под действием фермента гиразы. Ее компактная структура облегчает хранение огромных объемов генетической информации в ограниченном пространстве клетки. sc pDNA является стабильной, биологически активной и демонстрирует высокую эффективность трансфекции.
Кольцевая плазмидная ДНК (oc pDNA)
Эта форма возникает, когда одна нить sc pDNA разрывается («разрезается»). Это может происходить естественным образом во время роста бактерий или вызываться ультрафиолетовым облучением, активностью нуклеазы или механическим повреждением во время экстракции, а также зависит от температуры хранения после очистки. Потеря сверхспиральной структуры делает ее более расслабленной. oc pDNA может быть преобразована в линейную pDNA путем обработки эндонуклеазами.
Линейная плазмидная ДНК (linear pDNA)
Эта форма образуется, когда обе цепи sc pDNA разрываются в соседних местах или путем специфического расщепления рестрикционными эндонуклеазами.
Олигомерные конкатемеры
Они могут встречаться в любой из трех вышеупомянутых структурных форм. Здесь несколько плазмидных единиц соединены в одну цепь, но ведут себя идентично мономерам в процессах ферментативного расщепления. Конкатемеры обычно возникают в результате гомологичной рекомбинации после репликации плазмиды или во время самого процесса репликации. Примечательно, что чем больше фрагмент, вставленный в плазмиду, тем выше соотношение олигомеров к мономерам.
Сложности и стратегии процесса
Очистка плазмидной ДНК (pDNA) сопряжена с несколькими проблемами: целевой продукт составляет лишь около 3 % лизата E. coli, а большинство примесей имеют отрицательный заряд и молекулярный размер, схожий с pDNA, что затрудняет их отделение. Кроме того, конечная суперспирализованная pDNA должна соответствовать нормативным требованиям к чистоте (>90 %), что предъявляет более высокие стандарты к разрешению и контролируемости процесса.
pDNA очень чувствительна к силам сдвига и подвержена структурным повреждениям во время таких операций, как концентрирование, что приводит к изменению топологических форм и ухудшению качества продукта. Поэтому минимизация сил сдвига и использования таких технологий, как ультрафильтрация с тангенциальным потоком, помогает сохранить ее структурную целостность и высокую чистоту.
Традиционные хроматографические сорбенты имеют ограничения при очистке pDNA: из-за значительно большего размера молекул pDNA по сравнению с белками, они с трудом проникают в микропоры сорбента, что приводит к низкой связывающей способности и низкой эффективности массообмена. Высокая вязкость сырья и потенциальное загрязнение также могут привести к увеличению давления в колонке и увеличению времени обработки. Несмотря на эти недостатки, крупномасштабная очистка по-прежнему в основном опирается на процессы на основе сорбентов и хроматографии. Для решения этой проблемы все больше производителей pDNA обращаются к конвективным средам (таким как мембранные абсорберы и монолитные колонки) для повышения эффективности и производительности этапов хроматографии, тем самым стимулируя модернизацию процессов.
Cobetter Pultrix™ PS использует PES-мембрану в качестве хроматографической матрицы. Структура мембранного материала с крупными порами значительно увеличивает связывающую способность для крупных молекул плазмиды. В сочетании с уникальным конвективным механизмом массопереноса мембранной хроматографии эффективность таких кассет значительно превосходит эффективность традиционной колоночной хроматографии. Этап очистки сокращается с примерно 2 часов на цикл при использовании традиционных методов до всего 20 минут, что существенно повышает эффективность как разработки процесса, так и масштабирования производства. Что подразумевает быстрое, эффективное и масштабируемое решение для очистки плазмид.
СЭМ-изображение Pultrix™ PES
Пример использования мембранных абсорберов Cobetter Pultrix™ PS
Информация о материале
Информация о буфере
Подготовка образца
Элюат из мембраны Pultrix™ XQ доводили до конечной концентрации 2,2 М (NH₄)₂SO₄ с помощью буфера D. Затем проводили эксперименты в условиях, указанных в таблице ниже, с использованием мембраны Pultrix™ PS (объем слоя: 0,2 мл).
Поскольку объем тестовой мембраны невелик, а мертвый объем хроматографической системы имеет большее влияние, объем устанавливается относительно большим. После сбора пиков пробы отбираются для гель-электрофореза, измерения концентрации, ВЭЖХ и различных проверок на наличие примесей.
Результаты эксперимента
Результаты показали, что после обработки элюата мембраны Pultrix™ XQ с помощью мембраны Pultrix™ PS открытая кольцевая плазмида была практически полностью удалена на этапе промывки, а доля суперскрученных плазмид в элюате значительно увеличилась.
Остатки примесей
Мембранный адсорбер Pultrix™ PS (хроматография) обеспечивает выход очистки около 70%, увеличивая долю ссуперскрученных пДНК с 89,1% до 96,4% и эффективно контролируя остатки всех примесей.
Примечательно, что в ходе сравнительных испытаний, проведенных в рамках нескольких проектов, двухэтапный процесс очистки плазмидной мембранной хроматографии Cobetter привел к снижению остаточных примесей в конечном продукте по сравнению с традиционным трехэтапным методом.
Решение Cobetter для очистки плазмид
Стоимость и эффективность: традиционные хроматографические сорбенты и мембранные абсорберы Cobetter Pultrix™
На примере лизиса клеток в объеме 1 кг:
Выход плазмиды: 4 мг/г
Объем очищенного лизата: 45 л
Концентрация плазмиды: 0,089 мг/мл
Традиционные хроматографические сорбенты
Мембранные абсорберы Cobetter Pultrix™
