Малые нуклеиновые кислоты
Среди множества передовых областей биофармацевтических инноваций область малых нуклеиновых кислот продемонстрировала свой огромный потенциал и широкие перспективы применения. К препаратам на основе малых нуклеиновых кислот относятся антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), малые интерферирующие РНК (миРНК), микроРНК (миРНК) и нуклеиновые аптамеры и т. д., которые обычно состоят из 12–30 нуклеотидов и образуют одноцепочечную или двухцепочечную структуру. Каждый тип малых нуклеиновых кислот имеет свой уникальный механизм действия и преимущества и может оказывать терапевтическое воздействие, точно регулируя экспрессию генов или подавляя определённые последовательности генов (1).
Недавно учёные Виктор Амброуз и Гэри Руффкунд были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине 2024 года за открытие микроРНК (миРНК) и определении её роли в посттранскрипционной регуляции генов. После того как многие виды препаратов на основе нуклеиновых кислот, такие как ASO, миРНК и мРНК, совершили прорыв, РНК-терапия вновь привлекла широкое внимание.
В этой статье в основном рассматривается процесс производства препаратов на основе малых нуклеиновых кислот и применение технологии мембранной фильтрации, которая поможет всем эффективно решать практические задачи, возникающие в процессе производства малых нуклеиновых кислот.
Процесс производства малых нуклеиновых кислот — синтез
Существует два основных метода синтеза малых нуклеиновых кислот: твердофазный синтез и биосинтез. В настоящее время основным методом химического синтеза является твердофазный фосфорамидитный метод, при котором используется синтезатор для точного контроля порядка добавления нуклеотидов на твердофазном носителе и синтеза малых нуклеиновых кислот с определенными последовательностями в ходе нескольких циклов. Каждый цикл в основном включает четыре этапа: депротеинизация, связывание, окисление и закрытие (рис. 1а). Ключевые этапы общего производственного процесса включают синтез, расщепление и депротексирование, хроматографическую очистку, ультрафильтрацию, отжиг (например, для двухцепочечных олигонуклеотидов) и лиофильную сушку [3].
Этот метод твердофазного синтеза является надежным и универсальным и позволяет эффективно и массово синтезировать короткие и средние (5–80 нуклеотидов) и сильно модифицированные олигонуклеотидные последовательности, но он ограничен короткими модифицированными олигонуклеотидными последовательностями. Нуклеиновые кислоты, полученные с помощью биокатализа на основе полимеразы (рис. 1b), могут не иметь ограничений по длине последовательности, но контроль над положением, количеством и сложностью модифицированных нуклеотидов очень ограничен.
Рис. 1. Твердофазный синтез; б. Ферментативный синтез
Процесс производства малых нуклеиновых кислот — удаление примесей
Основные аспекты производства для малых нуклеиновых кислот включают в себя поставку мономеров, контроль качества, определение характеристик примесей, разделение и очистку и т. д. Среди них особенно важны и сложны анализ, определение характеристик и контроль связанных с ними примесей.
Например, при установлении допустимых пределов содержания примесей в фосфорамиде необходимо учитывать накопление, вызванное количеством циклов синтеза, на основе итеративных характеристик твердофазного синтеза. К олигонуклеотидам применимы соответствующие рекомендации ICH, в том числе в отношении примесей, связанных с процессом производства (генотоксичные примеси ICH M7), неорганических примесей (ICHQ3D) и остаточных растворителей (ICHQ3C). Подробнее см. соответствующие рекомендации [4].
Кроме того, подкомитет Рабочей группы по безопасности олигонуклеотидов (OSWG) также обсудил примеси, связанные с процессом производства и с продуктом, в препаратах на основе олигонуклеотидов (s-6]). К органическим примесям, связанным с технологическим процессом, относятся исходные материалы, лиганды, активаторы, герметизирующие агенты, сульфирующие агенты и защитные группы, которые обычно можно удалить в процессе синтеза, очистки и ультрафильтрации.
На этапе ультрафильтрации также можно эффективно удалить неорганические примеси в API до уровня ниже предела обнаружения. Примеси, связанные с продуктом, обычно представляют собой N-1, N-2, N-x (отсутствующие или короткие полимеры), примеси N+, длинные полимеры, неполностью депротектированные олигонуклеотиды, примеси фосфодиэфиров (P=0) и т. д.
Эти примеси могут быть эффективно удалены или сокращены до допустимого уровня в процессе хроматографической очистки. Накопление данных исторических исследований помогает подтвердить способность к удалению примесей в процессе разработки, тем самым обеспечивая минимальное обнаружение.
Процесс производства малых нуклеиновых кислот — химическая модификация
Однако разработчики лекарств на основе малых нуклеиновых кислот по-прежнему сталкивается с такими проблемами, как трудности с доставкой, иммуногенность и побочные эффекты. На протяжении многих лет в ходе изучения различных модификаций химической структуры и систем доставки химическому модифицированию подвергались различные элементы (как показано на рисунке 2).
Например, модификация фосфотиоатом (PS) миРНК и модификация рибозы 2′-F или 2′-OMe широко используются в коммерческих миРНК. Эти модификации могут повысить стабильность сыворотки, продлить период полураспада, усилить способность к РНК-интерференции и уменьшить побочные эффекты [1].
Однако, помимо химической модификации, для внутриклеточной доставки малых нуклеиновых кислот также необходима эффективная система доставки, среди которых LNP и GalNAc (N-ацетилгалактозамин) являются относительно зрелыми системами доставки, которые в настоящее время изучаются и применяются (как показано на рисунке 3). Система доставки GalNAc особенно эффективна при доставке в печень и, по сравнению с LNP, обладает более низкой иммуногенностью и лучшей безопасностью.
Система доставки LNP обладает относительно высокой универсальностью для доставки препаратов на основе нуклеиновых кислот и в настоящее время является основной формой доставки мРНК-вакцин. Для получения подробной информации о применении LNP, пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть <практическое руководство по мРНК-LNP и выбору области применения. Часть 1. Cobetter помогает в разработке эффективных процессов LNP.
Рисунок 2. Распространённые химические модификации олигонуклеотидов
Рис. 3. Распространённые системы доставки нуклеиновых кислот [1]: (A) вирусные векторы; (B-E) невирусные векторы
Cobetter’s solution is on the above small nucleic acid manufacturing and LNP delivery system process applications, Cobetter can provide efficient and reliable solutions. Some application cases of its membrane filtration technology are shown below:
Мембранные кассеты — выбор размера пор для работы с малыми нуклеиновыми кислотами:
Ультрафильтрация API
Для веществ, содержащих нуклеиновые кислоты, различия в последовательности нуклеиновых кислот, буферных системах, pH и температурных условиях могут приводить к различиям в пространственных структурах молекул. Поэтому при выборе размера пор ультрафильтрационных мембранных кассет не рекомендуется полагаться только на молекулярную массу для оценки и анализа. В некоторых случаях для подтверждения правильности выбора требуется фактическая проверка потока и наличия или отсутствия потерь в конце процесса.
Для ультрафильтрации малых количеств нуклеиновых кислот обычно используются мембраны с размером пор 3KD, 3KDH, 3KD, 2KD, 1KD и других размеров. Компания Cobetter предлагает вышеупомянутые кассеты с мембранами из регенерированной целлюлозы RC с различными размерами пор и характеристиками (см. рис. 4), которые могут удовлетворить потребности в удалении примесей при ультрафильтрации API, обессоливании и жидкостном обмене для различных последовательностей и объёмов.
Удаление эндотоксинов в API
С одной стороны, контроль уровня эндотоксинов в материалах с малыми нуклеиновыми кислотами зависит от условий производства, сырья, контактных ёмкостей и других материалов, а также от уровня эндотоксинов.
С другой стороны, его можно подвергнуть ультрафильтрации с использованием мембранных кассет с размером пор 30 кДа или 50 кДа, чтобы эффективно перехватить некоторые агрегаты эндотоксина. Таким образом, целевой продукт — малая нуклеиновая кислота — может быть собран на выходе из фильтра, а уровень эндотоксина может быть эффективно снижен до определённого уровня. Кроме того, для контроля эндотоксинов в соответствующих буферных растворах обычно используется ультрафильтрационная мембранная кассета с размером пор 6–10 кДа, которая позволяет достичь эффективности удержания и удаления более 99,99%. Для удаления эндотоксинов с высокой эффективностью и при высокой нагрузке также можно использовать анионную адсорбционную мембрану Purcise Q от Cobetter.
Рис. 4. Варианты кассет Cobetter RC
Метод ультрафильтрации и анализ практических примеров
Выбор размера пор
Для малых нуклеиновых кислот с молекулярной массой 6 кДа метод ультрафильтрации сравнивался с мембранными кассетами Cobetter 3 кДа и 2 кДа. Технологические данные следующие:
Таблица 1. Ультрафильтрация микроРНК – 2 кДа в сравнении с 3 кДа
Рис. 5. Изменение концентрации и диафильтрационного потока, а также кривой TMP с течением времени
Как видно из приведённых выше данных, при условии гарантированного выхода материала мембранные кассеты с высоким коэффициентом удержания 3KDH имеют более высокий поток в растворе с высоким содержанием соли и, по сравнению с мембранными кассетами 2KD, обладают определёнными преимуществами в отношении площади мембраны или времени обработки, необходимого для обработки того же объёма. Согласно оценочным данным нашей компании, мембранные кассеты 3KDH или 2KD обладают высокой универсальностью для различных небольших последовательностей нуклеиновых кислот с обычной длиной или молекулярной массой около 6–8 кДа, но на практике для оптимизации размера пор требуются сравнительные испытания в сочетании с общим потоком фильтрации, выходом, временем процесса и другими показателями.
Процесс ультрафильтрации
После очистки в составе малых нуклеиновых кислот обычно присутствуют органические растворители и соли, которые необходимо удалить с помощью диализа и ультрафильтрации. Однако в процессе ультрафильтрации из-за малого размера пор ультрафильтрационной мембраны даже при относительно высоком TMP уровень потока проницаемости всё равно остаётся относительно низким, что также приводит к тому, что время, необходимое для ультрафильтрации, часто бывает очень долгим. Поэтому определение оптимального коэффициента концентрации или времени замены жидкости в процессе ультрафильтрации особенно важно для сокращения продолжительности процесса.
В следующем примере проводится ультрафильтрационная концентрация малых нуклеиновых кислот в солевой системе и в системе с чистой водой соответственно, анализируется и оценивается оптимальный коэффициент концентрации или время замены жидкости в различных системах путем определения потока в реальном времени и соответствующей концентрации отфильтрованных частиц.
Как показано на рисунке 6, при ультрафильтрации отфильтрованных частиц в солевой системе поток через мембрану существенно не снижается с увеличением концентрации жидкости, в то время как в системе с чистой водой поток значительно снижается с увеличением концентрации жидкости. В процессе ультрафильтрации мы в основном ориентируемся на значение диапазона концентрации отфильтрованных частиц при более высоком уровне потока в системе с чистой водой как на оптимальное значение диапазона концентрации, а затем выполняем этап замены жидкости, что позволяет сократить время процесса.
Рис. 6. Подтверждение оптимальной точки диализа малых нуклеиновых кислот в солевых и водных системах
Подводя итог, можно сказать, что в процессе производства малых нуклеиновых кислот решения Cobetter могут применяться для ультрафильтрационной концентрации при жидкостном обмене, удалении эндотоксинов, стерилизационной фильтрации и мембранной хроматографической очистке препаратов АФИ и ЛНП. Более того Cobetter может предложить мешки для хранения без нуклеаз, мешки для смешивания, индивидуальные одноразовые компоненты и системы для обработки жидкостей.