Вакцины мРНК на основе плазмид, а также технология вирусных векторов находятся в авангарде борьбы с раком, сердечно-сосудистыми, иммунологическими и инфекционными заболеваниями. Чтобы полностью раскрыть их потенциал и охватить как можно больше пациентов, нам необходимо оптимизировать процесс производства для достижения большей эффективности, и ключевым этапом в этом процессе является производство плазмид.
Однако традиционные методы производства характеризуются низкой урожайностью плазмид и требуют сложных процессов очистки, поэтому сегодня мы представляем мембранный адсорбер (хроматографический) Cobetter Pultrix XQ для эффективной очистки плазмид.
Сложности процесса
Целевая плазмида составляет всего около 3% от общего количества лизата E. coli, и многие примеси имеют отрицательный заряд и схожи по размеру с плазмидой, что сильно затрудняет очистку плазмиды. Конечная очищенная ультраспиральная плазмида должна соответствовать стандарту чистоты, установленному регулирующим органом, и составлять >90%.
Кроме того, поскольку плазмиды очень чувствительны к силам сдвига, которые могут вызвать топологические изменения в процессе концентрирования. Для улучшения качества конечного продукта необходимо свести к минимуму ультрафильтрацию с тангенциальным потоком.
С одной стороны, плазмиды намного крупнее белков, что может привести к низкой нагрузке на связывание и медленной массопередаче для обычных хроматографических материалов из-за их большого размера и неспособности проникать в тупиковые поры упакованного в колонках сорбента. С другой стороны, увеличенный размер плазмиды также может существенно повлиять на перепад давления и время обработки из-за вязкости сырья и возможного загрязнения.
Несмотря на свои многочисленные недостатки, классический способ упаковки сорбента в колонки по-прежнему используются в крупномасштабных процессах очистки. Однако по мере развития производственных процессов и выпускаемой продукции производители плазмид также рассматривают возможность расширения этапа хроматографии за счет использования конвективных сред (например, мембран, монолитных колонок и т.д.), чтобы повысить производительность и увеличить общую пропускную способность.
Решение от Cobetter
Мембранный адсорбер Pultrix XQ значительно превосходит традиционные сорбенты. Каналы конвективного потока, создаваемые структурой мембраны с большими порами, высокая плотность участков связывания четвертичных аммониевых солей и высокая эффективность массопереноса позволяют участкам связывания мембранного адсорбера Pultrix XQ быстро захватывать более крупные целевые молекулы (например, плазмиды) при высоких скоростях потока, достигая при этом требуемой для производства GMP чистоты. Таким образом, мембранный адсорбер Pultrix XQ обеспечивает значительное повышение производительности (г/л/час).
Мы используем мембрану XQ для улавливания плазмид при нагрузке ~8 мг/мл непосредственно после осветления лизата с помощью соответствующего количества раствора P3 (или твёрдого NaCI), а затем элюируем для получения чистых плазмид, которые могут удалить из лизата >99,99% РНК. Мембранный адсорбер Pultrix XQ обеспечивает чистоту плазмиды ≥99% (плазмида SC >90%), выход >80% и время работы в цикле сбора лизата всего 30 минут (при RT=6S). минут в цикле сбора лизата (при RT=6S и скорости потока 10 мВ/мин).
Помимо производительности, простая в установке и масштабируемая конструкция капсулы сокращает время предварительной обработки и занимаемую площадь, позволяя работать в различных производственных условиях, устраняя необходимость в загрузке колонок и измерении эффективности, а также обеспечивая простой и быстрый доступ.
В целом, повышенная производительность и простота эксплуатации делают мембранный хроматографический адсорбер Pultrix XQ отличным решением для производства плазмид.
Исследование
Исходным материалом для процесса улавливания с помощью мембранного адсорбера Pultrix XQ является лизат E. coli.
Таблица 1. Лизат для концентрации соли в классической системе лизиса
Cracking system P1:P2:P3=15:15:15
РНК в меньшей степени связывается с анионообменной средой, чем более сильно заряженные плазмиды. Поэтому перед загрузкой в мембранный адсорбер Pultrix XQ в лизат добавляют соль (например, добавляют раствор Р3 в соответствующем количестве) для достижения лучших условий проводимости. Так что примеси, такие как РНК, проходят через мембранный адсорбер Pultrix XQ, а плазмиды связываются с высокой нагрузкой и элюируются с высокой чистотой плазмид на последующем этапе элюирования.
Это позволяет напрямую захватывать плазмиду в лизате без использования РНКазы или CaCl для осаждения РНК. Кроме того, было обнаружено, что при соответствующей концентрации соли плазмида, образующая кольцо, проходит через лизат раньше, чем суперспиральная плазмида, из-за конкуренции за адсорбцию, поэтому контроль количества образца может помочь увеличить общую долю суперспиралей.
Таблица 2. Информация о материалах, оборудовании и расходных материалах
Таблица 3. Информация о буферном растворе
Эксперименты проводились с использованием мембран Pultrix XQ (MV: 0,3 мл) в соответствии с условиями, указанными в таблице ниже:
Таблица 4. Условия эксперимента
В процессе отбора проб были взяты проточные образцы, которые были элюированы и собраны в соответствии с пиками, а затем отобраны для нанесения на гель, измерения концентрации, ВЭЖХ и проверки различных примесей. Результаты приведены ниже:
Таблица 5. Результаты экспериментов
Результаты экспериментов показывают, что мембранный адсорбер Pultrix XQ обеспечивает одноэтапный улов плазмид с выходом 80+%, соотношение суперспиральных плазмид составляет 90+%, а также позволяет эффективно контролировать примеси, такие как эндотоксин, HCD и т. д.
В рамках проекта было успешно достигнуто стабильное линейное масштабирование на Pultrix XQ95 мл с двумя циклами на партию и общим временем процесса менее 90 минут.
Сравнение затрат и эффективности: мембранный адсорбер и упаковка колонки сорбентом
