При вестерн-блоттинге на результат эксперимента влияют такие факторы, как свойства белков (заряд, гидрофобность и т. д.), выбор буферов и неспецифическое связывание с другими белками. Однако выбор подходящей мембраны является одним из наиболее важных факторов для успешного переноса белков. Поливинилиденфторидные (PVDF) и нитроцеллюлозные (NC) мембраны для переноса являются двумя наиболее часто используемыми мембранами при вестерн-блоттинге. В этой статье мы сравним их свойства и области применения, чтобы вам было проще выбрать лучшую мембрану для вашего эксперимента.
Мембрана PVDF
Мембрана для переноса PVDF (поливинилиденфторида) по своей природе гидрофобна. Белки связываются с мембранами PVDF посредством дипольных и гидрофобных взаимодействий. Она больше подходит для обнаружения высокомолекулярных белков.
Преимущества
Высокая способность связывать белки. Мембрана PVDF обладает высокой способностью связывать белки – 150-300 мкг/см2, что также означает высокую чувствительность. Эта особенность делает мембрану PVDF идеальной для обнаружения белков с низкой экспрессией.
Долговечность
Мембрана PVDF обладает более высокой химической стойкостью и более долговечна, что предотвращает ее растрескивание, разрыв или скручивание при обработке. Ее высокая химическая стойкость хорошо сочетается с такими распространенными красителями, как коллоидное золото, Кумасси Блю и Понсо-С. Кроме того, его высокая гидрофобность способствует удержанию белка, уменьшая его потерю после связывания. Эти особенности делают мембраны PVDF идеальными для многократного удаления и повторного зондирования.
Удаление первичных и вторичных антител с вестерн-блоттинга — это метод удаления первичных и вторичных антител с мембраны, позволяющий повторно нанести на неё антитела. Теоретически, можно многократно удалять и повторно наносить антитела, чтобы визуализировать разные белки или оптимизировать условия эксперимента без использования нескольких гелей и переноса белков. Удаление и повторное нанесение антител обычно выполняются при анализе нескольких белков с помощью разных антител или при повторной оценке неожиданных результатов.
Недостатки
Фоновый шум: Высокая чувствительность мембраны PVDF может быть недостатком при обнаружении белков с высокой экспрессией, поскольку это может привести к неспецифическому связыванию, что приводит к более высокому фоновому шуму.
Предварительная обработка: Перед переносом белка мембрана для переноса PVDF должна быть предварительно смочена (также называется активированной) в метаноле или этанольной воде. Метанол является наиболее часто используемым растворителем для активации. После активации метанолом мембрану можно использовать с буфером для переноса, не содержащим метанол.
Автофлуоресценция: Как PVDF, так и нитроцеллюлоза совместимы с вестерн-блоттингом на основе хемилюминесценции. Однако при детектировании флуоресценции с помощью стандартной мембраны PVDF автофлуоресценция может приводить к высокому фоновому шуму. При проведении флуоресцентного вестерн-блоттинга следует выбирать PVDF-мембраны с низкой флуоресценцией. Рекомендуется вырезать небольшой образец PVDF-мембраны и сфотографировать его как влажным, так и сухим, чтобы оценить уровень автофлуоресценции мембраны, прежде чем использовать его для вестерн-блоттинга.
NC-мембрана
NC (нитроцеллюлозная) мембрана является гидрофильной. Считается, что взаимодействие между белками и нитроцеллюлозными мембранами является нековалентным и гидрофобным. Высокая концентрация соли и низкая концентрация метанола могут повысить эффективность иммобилизации нитроцеллюлозных мембран. Нитроцеллюлозная мембрана идеально подходит для обнаружения белков средней и низкой молекулярной массы.
Преимущества
Низкий уровень фонового шума: способность нитроцеллюлозной мембраны связывать белки составляет 80–100 мкг/см². Это делает её пригодной для большего количества применений и, как правило, более дешёвой, чем мембрану для переноса из поливинилиденфторида. Более низкая чувствительность и меньший фоновый шум делают мембрану NC идеальной для обнаружения белков с высоким содержанием.
Готова к использованию: мембрана из нитроцеллюлозы не требует предварительной обработки (НЕ смачивайте мембрану метанолом, иначе она растворится), но требует наличия метанола в буфере для переноса.
Это связано с тем, что метанол помогает удалить SDS, маскирующий белки, что позволяет белкам более эффективно связываться с мембраной NC. Однако метанол может уменьшить размер пор геля, изменить заряд белка и вызвать осаждение крупных белков. Рекомендуется проверять концентрацию метанола в соответствии с условиями эксперимента. В некоторых протоколах 20% метанола заменяют 10% этанолом в буфере для переноса.
Недостатки
Хрупкость: нитроцеллюлозная мембрана механически слабая и ломкая, что затрудняет её снятие и повторное нанесение без потери сигнала при промывке антител. Однако нитроцеллюлозные мембраны с подложкой гораздо более прочные и устойчивые, чем стандартные, что позволяет снимать с них покрытие, повторно наносить его и выдерживать агрессивную химическую обработку.
Сравнительная таблица
| Особенность | Мембрана PVDF | NC мембрана |
| Способность связывать белки | 150-300 мкг/см2 | 80-100 мкг/см2 |
| Размер белка | Лучше для белков с высоким содержанием MW | Лучше подходит для белков со средним и низким содержанием жиров |
| Гидрофильный / гидрофобный | гидрофобный | гидрофильный |
| Долговечность | Высокий | Низкий |
| Химическая стойкость | Высокий | Низкий |
| Фоновый шум | Может быть высоким | Низкий |
| Требование к предварительному увлажнению | Требуется предварительное смачивание метанолом или этанолом | Требуется метанол в буфере для переноса |
| Повторное применение | Работает хорошо | Не рекомендовано |
| Автофлуоресценция | Высокая для стандартной мембраны PVDF | Низкий |
| Обнаружение | Хемилюминесцентное обнаружение. Для флуоресцентного обнаружения лучше выбирать специальные мембраны из PVDF с низкой флуоресценцией. | Обнаружение как хемилюминесценции, так и флуоресценции |
| Стоимость | Высокая | Низкая |
Выбор подходящей мембраны для трансфера для вашего эксперимента
Вот краткое руководство, которое поможет вам выбрать подходящую мембрану.
Когда следует выбирать мембрану для переноса из PVDF:
Обнаружение высокомолекулярных белков: Мембрана из PVDF обладает лучшей способностью связываться с высокомолекулярными белками.
Обнаружение белков с низкой экспрессией: высокая связывающая способность мембраны PVDF делает ее идеальной для обнаружения белков с низкой экспрессией.
Необходимость многократного удаления: Мембрана PVDF обладает большей прочностью и химической стойкостью, чем мембрана NC. Ее высокая способность связывать белки также помогает удерживать белки в процессе удаления и повторного применения.
Когда выбирать нитроцеллюлозную мембрану:
Обнаружение белков со средней и низкой молекулярной массой: Мембрана NC обладает лучшей эффективностью связывания с белками с низкой молекулярной массой, чем мембрана PVDF.
Экономичность: Нитроцеллюлозная мембрана, как правило, дешевая и отвечает большинству требований эксперимента. Если вам нужна экономичная и простая в использовании (не требующая предварительного смачивания) разделительная мембрана, это хороший вариант.
Минимизация фонового шума: если минимизация фонового шума является приоритетом, нитроцеллюлозная разделительная мембрана может стать лучшим выбором.
О размере пор
Мембраны из поливинилиденфторида и нитроцеллюлозы доступны с размером пор 0,2 мкм и 0,45 мкм.
0,2 мкм: подходит для обнаружения белков с низкой молекулярной массой. Обладает более высокой способностью связывать белки и удерживать их, чем мембрана толщиной 0,45 мкм. Особенно подходит для белков массой менее 20 кДа и рекомендуется для обнаружения белков с низким содержанием.
0,45 мкм: подходит для общего обнаружения методом вестерн-блоттинга. Идеально подходит для белков массой более 20 кДа и обеспечивает низкий уровень фонового шума.
Заключение
Как PVDF, так и нитроцеллюлозные мембраны имеют свои преимущества при проведении вестерн-блоттинга. При выборе мембраны для переноса учитывайте такие факторы, как размер белка, чувствительность обнаружения, требования к удалению и повторному зондированию, бюджетные ограничения и т.д.
Если вам нужна высокая чувствительность и вы планируете снять и повторно протестировать передающую мембрану, лучшим вариантом будет PVDF. С другой стороны, если вы ищете экономичную, простую в использовании мембрану с минимальным фоновым шумом, нитроцеллюлоза – отличный выбор.