В последние годы удаление эндотоксинов становится актуальной темой в процессе производства биофармацевтических препаратов. В частности, проблема избыточного содержания эндотоксинов после многократного концентрирования и фильтрации стала предметом пристального внимания исследователей в области биофармацевтики.
Подробнее об эндотоксинах
Эндотоксин – это разновидность липополисахарида (ЛПС) с единицей измерения EU. Это основной компонент внешних липидов во внешней мембране клеточных стенок грамотрицательных бактерий, которые высвобождаются, когда клетки умирают или разлагаются. Когда эндотоксины попадают в кровь или ликвор, они могут вызывать лихорадку и поэтому известны как пирогены. Согласно соответствующим нормативным актам, в процессе производства лекарств, инъекционных биологических препаратов и некоторых питательных сред для культивирования тканей необходимо принимать меры по удалению эндотоксинов.
Как удалить эндотоксин?
Из-за присутствия отрицательно заряженных фосфатных и карбоксильных групп в эндотоксинах их мономерная изоэлектрическая точка составляет около 2, что является относительно низким показателем. В растворах с рН>2 эндотоксины проявляют электроотрицательность. Таким образом, ионообменная хроматография является одним из широко используемых методов депирогенизации белков.
Однако традиционные методы хроматографии имеют недостатки, которые также ограничивают их применение на этапах удаления токсинов. К ним относятся эксплуатационные проблемы, такие как упаковка колонок, утомительная работа, низкая скорость потока, длительное время регенерации и ограниченная химическая стабильность. Таким образом, низкие скорости потока и чувствительность к загрязнению означают, что внедрение хроматографического метода на крупномасштабных стадиях очистки является громоздким и дорогостоящим процессом. В ответ на эту сложную проблему компания Cobetter разработала и внедрила инновационную технологию высокопроизводительного, масштабируемого и готового к использованию мембранного адсорбера Purcise™ Q strong с анионообменной мембраной. Наш мембранный адсорбер отличается высокой скоростью потока, высокой загрузочной способностью и простотой в эксплуатации, что позволяет удовлетворять все возрастающие потребности в удалении эндотоксинов – от лабораторных исследований до производственного процесса.
Исследование Cobetter
Мы обнаружили, что при концентрировании белка с использованием кассет TFF 10 кДа эндотоксины в образце и промывочном буфере постепенно увеличиваются по мере процесса концентрирования и фильтрации. А в процессе концентрирования эндотоксины усиливают свою адсорбцию белками, что затрудняет их окончательное удаление.
Компания Cobetter немедленно провела внутреннее исследование, основанное на описанной выше ситуации, и предложила новый подход к удалению эндотоксина. Перед концентрацией образцы и обменный буфер предварительно обрабатываются эндотоксином с помощью мембранного адсорбера Purchase™ Q. Таким образом вы контролируете уровень эндотоксинов в процессе, чтобы гарантировать, что остаточные эндотоксины остаются в пределах допустимого диапазона после концентрирования и замены буфера.
Предпосылки исследования
Согласно исследованиям рынка и отзывам, известны случаи превышения или приближения к пределу обнаружения эндотоксина в препаратах с высокой концентрацией. В частности, при использовании кассет TFF емкостью 10 кДа для получения конечных растворов путем предварительного концентрирования, фильтрации и последующего концентрирования остаточный эндотоксин в конечных растворах приближается к пределу или превышает его в нескольких партиях. Согласно предварительному анализу, проведенному научно-исследовательской группой Cobetter, это явление вызвано адсорбцией белков и эндотоксинов в высоких концентрациях, что изменяет распределение их заряда и в конечном итоге приводит к нарушению адсорбции эндотоксинов. Исходя из вышеизложенной ситуации, мы провели углубленное тестирование и исследование.
Эксперимент 1: влияние буферных условий
Приготовьте раствор для удаления эндотоксинов на основе тех же компонентов (гистидин, манноза, твиновая система), что и в белковом буфере. Благодаря наличию в буфере поверхностно-активного вещества Tween, в ходе эксперимента также было исследовано влияние мембранного адсорбера Tween to Purchase™ Q на удаление эндотоксинов.
Приготовьте пробный буфер 1: UF/DF буфер (remove Tween), добавьте стандартный раствор эндотоксина и приготовьте пробный раствор с конечной концентрацией 3 EU/мл.
Приготовьте пробный буфер 2: UF/DF буфер (with Tween), добавьте стандартный раствор эндотоксина и приготовьте пробный раствор с конечной концентрацией 3 EU/мл.
Оба пробных буфера были отфильтрованы с помощью мембранного адсорбера Purchase™ Q объемом 0,9 мл со скоростью потока 9 мл/мин. Объем фильтрации: 90 мл.
Результаты теста приведены ниже:
Результаты тестирования показали, что компоненты буфера не влияют на эффективность удаления эндотоксинов мембранным адсорбером Purchaser™ Q.
Эксперимент 2: влияние остаточных количеств эндотоксина в буфере
Концентрируйте буфер (гистидин, маннозу, Tween system) непосредственно с помощью кассеты TFF емкостью 10 кДа и определяйте остаточные эндотоксины в концентрированном буфере. Приготовьте 4 л буфера для обмена МКФ/DF и разделите его на две части.:
Экспериментальная группа: Отфильтровать 2 л буфера мембранным адсорбером Purchase™ Q объемом 5 мл со скоростью 10 МВ/мин (мгновенный отбор проб при фильтрации 1 л и 2 л для выявления остаточных эндотоксинов). Сконцентрируйте отфильтрованный раствор и возьмите пробы для определения остаточных эндотоксинов в 10-кратной и 40-кратной концентрации соответственно
Контрольная группа: Непосредственно сконцентрируйте 2-литровый буфер и возьмите пробы для определения остаточных эндотоксинов в 10-кратной и 40-кратной концентрации Результаты теста следующие:
Из результатов сравнительного эксперимента следует, что в процессе концентрирования остаточные количества эндотоксинов постепенно увеличиваются и это влияет на качество конечных продуктов. Особенно при высокой концентрации риск превышения нормы содержания эндотоксинов резко возрастает. При использовании мембранного адсорбера Purcisie™ Q можно эффективно контролировать остаточные количества эндотоксинов в буфере, что снижает риск превышения нормы содержания эндотоксинов в процессе концентрирования.
Эксперимент 3: Контроль содержания эндотоксина перед ультрафильтрацией
Перед концентрированием проводили контроль содержания эндотоксина в образцах белка и буфере (гистидин, манноза, система Tween) отдельно с помощью мембранного адсорбера Purcisie™ Q, затем проводили концентрирование для получения конечного раствора.
Подготовка образцов:
Подготовка образцов белка: отфильтровать 1 л образцов белка (концентрация: ~8,0г/л на мембранный адсорбер-шприц Purcise™ Q объемом 0,9 мл) со скоростью потока 4,5 мл/мин для удаления свободного эндотоксина, остаточного эндотоксина после фильтрации ≈0,05EU/мл. ;
Приготовление буфера UF/DF: отфильтруйте 5 л буфера для приготовления с помощью мембранного адсорбера-шприца Purcise™ Q объемом 5 мл со скоростью потока 50 мл/мин (5 МВ/мин), чтобы удалить следы эндотоксина, остаточный эндотоксин после фильтрации составляет 0,02 EU/мл.
Белок концентрируют, фильтруют и затем концентрируют еще раз:
5 раз концентрируют 1 л белкового раствора и используют буфер UF/DF для 8-кратной замены. После завершения замены выполните 3-кратную концентрацию для получения окончательного раствора. Второй процесс концентрирования после обмена заключается в мгновенном отборе проб по частям для выявления остаточных эндотоксинов.
Результаты теста следующие:
*Контрольная группа в этом эксперименте: белок непосредственно концентрируется, фильтруется и затем концентрируется для получения конечного раствора.
После тестирования было обнаружено, что остаточное содержание эндотоксина в исходном растворе превышает 1 EU/мл. Результаты эксперимента показывают, что после использования мембранного адсорбера Purcise™ Q для контроля эндотоксинов в процессе UF/DF из исходного раствора конечное содержание эндотоксина в исходном растворе можно контролировать в пределах 0,5 EU/мл, что значительно ниже, чем раньше.
Этот план не только улучшает качество продукции, но и снижает риск заражения эндотоксинами в процессе производства. Поэтому в процессе концентрирования и замены буфера рекомендуется использовать мембранный адсорбер Purcise™ Q для предварительной адсорбционной обработки эндотоксина отдельно для образца и буфера для замены перед концентрацией образца. Контроль содержания эндотоксинов в технологическом процессе позволяет гарантировать, что остаточные эндотоксины остаются в пределах допустимого диапазона после окончательного концентрирования и замены.