Что такое MWCO?
Molecular weight cut-off (MWCO) – это термин в мембранной фильтрации для описания размера пор или способности ультрафильтрационной мембраны к удержанию. MWCO ультрафильтрационной мембраны – это порог отсечения по молекулярной массе, то есть молекулярный вес молекулы, которая задерживается мембраной на 90%, обычно неионных растворителей, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстраны и различные белки с разным молекулярным весом.
MWCO измеряется в дальтонах (Da) или килодальтонах (kDa), при этом 1 kDa равен 1000 Da. Один атом водорода имеет массу 1 дальтон (Da), а молекулярные массы белков и других макромолекул принято измерять в килодальтонах (kDa) или просто kD. Для оптимального извлечения большинства макромолекул рекомендуется, чтобы MWCO выбранной ультрафильтрационной мембраны составляла от 1/3 до 1/2 молекулярной массы целевой молекулы.
Как MWCO влияет на выделение?
Выбор мембраны с низкой молекулярной массой (MWCO) может улучшить показатели извлечения, но одновременно может снизить скорость ультрафильтрации и привести к удержанию загрязняющих веществ с более низкой молекулярной массой. И наоборот, выбор мембраны с большим MWCO, что означает большую площадь поверхности, может привести к увеличению неспецифического связывания и проницаемости.
Чтобы обеспечить эффективное разделение, очень важно выбрать соответствующую мембрану с отсечкой по молекулярной массе (MWCO). После определения объема образца самым важным шагом является определение молекулярной массы молекул образца. Это необходимо для выбора подходящего отсекателя молекулярной массы мембраны (MWCO).
Как правильно выбрать MWCO для ДНК, РНК и белков?
Выбор MWCO для РНК
Средняя молекулярная масса рибонуклеотида составляет 339,5 Da, но когда нуклеотиды соединяются, образуя рибонуклеиновую кислоту (РНК), одна молекула воды удаляется, в результате чего средняя молекулярная масса рибонуклеотида в РНК должна быть рассчитана как 321.5 Da. Если предположить, что наша целевая мРНК состоит из n рибонуклеотидов, то ее молекулярная масса может быть рассчитана как 321.5n Da. В соответствии с тем, что размер пор ультрафильтрационной мембраны должен составлять 1/3 молекулярной массы целевой мРНК, MWCO ультрафильтрационного фильтра должна составлять 107n Da.
Например, рассмотрим сценарий, когда длина целевой мРНК составляет 1000 нт. Ее молекулярная масса составляет 321.5*1000 Da=321.500 (Da=321.5 кДа), и она должна быть удержана ультрафильтрационной мембраной с MWCO 107 кДа.
Применяя следующую формулу в обратном порядке, мы можем получить различные характеристики MWCO, соответствующие минимальной длине целевой мРНК (единица измерения: nt), что также означает минимальное количество рибонуклеотидов, которые должна содержать целевая мРНК.
Например, рассчитаем минимальную длину мРНК, необходимую для удержания ультрафильтрационной мембраной с MWCO 100 кДа, по следующей формуле:
1000нт/х = 107кДа/100кДа; х=935нт
Это означает, что пока наша мРНК состоит из более чем 935 рибонуклеотидов, мы можем эффективно использовать центробежный фильтр на 100 кДа для ее обработки.
Применяя логику расчета, описанную выше, мы можем получить следующую таблицу:
| Минимальная длина (nt) | Центрифужные пробирки для ультрафильтрации (кДа) |
| 28 | 3 |
| 94 | 10 |
| 281 | 30 |
| 468 | 50 |
| 935 | 100 |
Выбор MWCO для ДНК
Аналогичным образом, средняя молекулярная масса дезоксирибонуклеотидов составляет 327 Da, а при образовании дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) удаляется одна молекула воды. Следовательно, средняя молекулярная масса дезоксирибонуклеотидов в ДНК рассчитывается как 309 Da.
Если предположить, что наша целевая нить ДНК состоит из n дезоксирибонуклеотидов, то ее молекулярная масса составит 309n Da. В соответствии с тем, что MWCO ультрафильтрационного центробежного фильтра должна составлять 1/3 от молекулярной массы целевой ДНК, MWCO выбранного центробежного фильтра должна составлять 103n Da.
Например, нить ДНК длиной 1000 нт имеет молекулярную массу 309*1000 Da = 309 000 Da = 309 кДа, которая должна быть удержана ультрафильтрационной мембраной с MWCO 103 кДа.
| Минимальная длина (nt) | Центрифужные пробирки для ультрафильтрации (кДа) |
| 30 | 3 |
| 97 | 10 |
| 292 | 30 |
| 486 | 50 |
| 971 | 100 |
Выбор MWCO для белков
Средняя молекулярная масса аминокислоты составляет приблизительно 128 Da, а когда одна молекула воды удаляется для образования белка, средняя молекулярная масса аминокислотного остатка в пептидной цепи становится приблизительно 110 Da.
В качестве примера, для иммуноглобулина IgG каждая из двух тяжелых цепей обычно состоит из примерно 450-550 аминокислотных остатков (для расчета используйте 500), а каждая из двух легких цепей состоит из примерно 214 аминокислотных остатков. Следовательно, молекулярная масса IgG может быть оценена примерно в 1420*110 Da, что составляет около 156 кДа.
Вот некоторые распространенные молекулярные массы белков и соответствующие MWCO, которые следует рассмотреть:
| MW concentration | MW(Da) | MWCO |
| Chymotrypsinogen / Химотрипсиноген (1mg/mL) | 25000 | 3K |
| Cytochrome C / Цитохром С (0.25mg/mL) | 12400 | 3K |
| Lysozyme / Лизоцим (0.25mg/mL) | 14400 | 3K |
| Ovalbumin / Овальбумин (1mg/mL) | 45000 | 10K |
| Chymotrypsinogen / Химотрипсиноген (1mg/mL) | 25000 | 10K |
| BSA(1mg/ml) | 67000 | 30K |
| Ovalbumin / Овальбумин (1mg/ml) | 45000 | 30K |
| Thyroglobulin / Тиреоглобулин (0.5mg/ml) | 677000 | 100K |
| IgG(1mg/ml) | 156000 | 100K |
Этот метод не является абсолютным, поскольку форма и структура белков могут быть сложными. Однако он служит практическим подходом для предварительного отбора и выбора мембран для конкретного применения. Для разделения полезны следующие эмпирические правила:
- Для разделения двух растворителей с разной молекулярной массой их молекулярные массы должны отличаться в 10 раз.
- MWCO мембраны должна составлять не менее 1/2 молекулярной массы растворителя, который необходимо удержать.
- Влияние формы молекулы на разделение. При работе с примерно глобулярными молекулами лучше всего сначала протестировать центробежный фильтр с MWCO, равным или немного меньшим, чем молекулярная масса целевой молекулы.
- При работе с образцами без эталона рекомендуется начинать с выбора центробежного фильтра с молекулярной массой, равной половине молекулярной массы целевой молекулы.