Перфузионный подход широко используется во многих клинических проектах благодаря таким преимуществам, как непрерывное добавление питательных веществ, своевременное удаление отходов метаболизма, а также способность поддерживать высокую плотность клеток и их жизнеспособность в течение длительного периода времени, тем самым достигая эффекта повышения титра клеток. Разработанный компанией Cobetter модуль ATF на полых волокнах диаметром 0,2 мкм демонстрируют отличные показатели в перфузионной культуре N-1, при этом плотность клеток CHO достигает 60E6 клеток/мл на D7 и сохраняется их высокая жизнеспособность.
Предприятия стремятся сократить расходы и увеличить производственные мощности за счет применения новых технологий без существенных изменений в рамках имеющихся производственных мощностей. В перфузионной культуре клеток используются устройства для удержания клеток и непрерывное обновление среды для достижения и поддержания высокой плотности и активности клеток в течение длительного периода времени. Устройство для удержания клеток оставляет их в биореакторе, одновременно добавляя свежую культуральную среду и непрерывно удаляя отходы и обедненную питательными веществами культуральную среду, таким образом обеспечивая качественную среду для роста и метаболизма клеток. Благодаря своей способности быстро увеличивать эффективность процессов, технология перфузии N-1 является эффективным методом повышения уровня экспрессии и сокращения времени процесса, и все чаще применяется биофармацевтическими компаниями.
В этой статье мы обобщим знания о перфузии N-1 на основе существующих примеров использования технологии и представим решения, которые компания Cobetter может предложить в процессе перфузионного культивирования.
Преимущества N-1 Perfusion
Чтобы уменьшить амплификацию биореакторов, пользователи обычно используют биореакторы меньшего размера для подготовки посевного состава высокой плотности, который непосредственно инокулируется в биореактор последней стадии (т.е. N-стадии) для производства белка или амплификации вируса. Этот метод называется стратегией высокой плотности N-1.
Перфузия N-1 – это форма посевного материала, направленная на усиление роста клеток на этапе, предшествующем производственному биореактору (N). Этот улучшенный процесс может быть достигнут путем подключения устройства для удержания клеток (например, устройства ATF) к биореактору N-1 для получения высокой плотности и активности клеток, тем самым засевая производственный биореактор с более высокой начальной плотностью клеток и сокращая время работы производственного биореактора. Это может значительно увеличить производительность производства без непосредственного изменения основного о процесса. Таким образом, стратегия N-1 позволяет сэкономить время и стоимость посева клеток, что имеет большое значение для развития процессов культивирования клеток в биофармацевтических компаниях.
Экспериментальные материалы：
Фильтр из полых волокон (HFF): Cobetter 0,2 мкм
Биореактор: WAVE 25 и 20л перфузионный мешок WAVE
Компонент перфузии ATF2: контроллер C24
Тип клеток: клетки CHO
Перфузионная система: Базовая
Подача: подача C
Рисунок 1 Плотность клеток в перфузионной культуре
Методология:
CHO высевали в биореактор WAVE при плотности 0,4E6 клеток/мл. После того как плотность клеток достигала 5E6 клеток/мл, начиналась перфузия, и соотношение перфузии регулировалось в зависимости от роста клеток для получения посевного состава N-1 высокой плотности. На 7-й день культивирования плотность клеток достигла 60E6 клеток/мл, а жизнеспособность клеток оставалась выше 95 % на протяжении всего периода культивирования, что свидетельствует о хорошем состоянии роста клеток.
Рисунок 2 Жизнеспособность клеток в перфузионной культуре
Перфузионный мешок WAVE 25 производства Cobetter оснащен погружной трубкой и подключен к компонентам ATF. Питательная/базовая среда непрерывно закачивается в 10-л культивационную емкость в соотношении 5% для достижения высокой плотности N-1 перфузионной культуры. В период логарифмического роста плотность клеток в этой системе может соответствовать амплификации производства 1000 л партии.
Вывод по N-1 перфузии：
По сравнению с традиционным подходом, увеличение плотности инокуляции в перфузии N-1 является основным фактором повышения урожайности. Значительное увеличение уровня экспрессии в основном связано с более высокой VCD и удельной продуктивностью клеток. Перфузионная культура позволяет продлить период роста клток и тем самым добиться высокой плотности культуры клеток. Клетки, выращенные методом перфузии N-1, могут быть инокулированы в производственный биореактор в соотношении 1:100, что значительно сокращает количество биореакторов, экономит время и в конечном итоге позволяет достичь снижения затрат.
Разработанные компанией Cobetter модули из полых волокон изготавливаются путем капсулирования полых волокон в полипропиленовую оболочку. Оболочка имеет концевые фитинги, каждый из которых включает два порта: входной питающий порт, порт рефлюкса и два порта пермеата. В портах могут использоваться адаптеры и соединители различных типов и размеров. Длина полого волокна совпадает с длиной оболочки, проходящей от питающего порта до порта рефлюкса. При использовании жидкость из питающего порта перекачивается под давлением. Большая часть жидкости проходит через полые волокна и выходит через рефлюксный порт. Часть материала проходит через стенки полых волокон, попадает в оболочку, а затем вытекает через порт пермеата.
Характеристики модулей из полых волокон Cobetter:
– Низкая биологическая нагрузка, нетоксичность для клеточных культур
– 100-процентное тестирование целостности
– Соответствие стандартам биосовместимости
– Способствуют росту клеток и увеличивают их плотность в режиме перфузии